今天分享一篇关于默许根瘤单细胞的文章。
氮素是蛋白质与核酸等生命体的基本组成元素，参与植物的生长发育、物质合成与代谢等生物学过程。空气中氮元素丰富，但植物不能直接利用。当前，农业生产主要通过大量施用氮肥来提高作物产量，人工合成氮肥耗费大量能源，并造成严重的生态环境污染。
1888年，德国科学家发现豆科植物与根瘤菌共生可以将氮气转化成植物需要的氮素营养。在豆科植物-根瘤菌共生中，豆科植物为根瘤菌提供合适的固氮环境及生长所必需的碳水化合物；作为回报，根瘤菌将氮气转变成含氮化合物，满足豆科植物对氮元素的需求。另外，固定的氮素也会释放到土壤中，被其他植物利用。能够与固氮细菌进行共生固氮的物种只分布于豆目、蔷薇目、葫芦目和壳斗目中，以豆科植物-根瘤菌共生固氮研究较多。
生物固氮是农业可持续发展的重要方向之一，其中，豆科植物与根瘤菌共生固氮是全球生物固氮总量贡献最大的模式。根瘤是豆科植物与根瘤菌共生固氮的场所，在这一特殊器官中发生着复杂的物质、能量、信息交流与转化。2020年12月10日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王二涛研究团队在《自然》上发表论文An SHR–SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation，揭示豆科植物皮层细胞获得SHR-SCR干细胞分子模块，使其有别于非豆科植物。这或是豆科植物共生结瘤固氮的前提事件，回答了“为什么豆科植物能结瘤固氮”这一科学问题。
根瘤可分为定型根瘤（如大豆、百脉根等）和不定型根瘤（如苜蓿、豌豆等），其中不定型根瘤呈现为棒状，具有持续分化的顶端分生组织，空间上从远端到近端可分为不同区域，细胞类型更加复杂；然而，不定型根瘤目前尚无系统性的细胞类型分析，不同细胞类型之间的交互和关联也尚不清楚。
所以这个文章以苜蓿为对象，用单细胞技术去解析共生固氮新机制。
========实验设计=======
研究人员以截形苜蓿 14 dpi的根瘤为样本。首先优化了根瘤原生质体裂解和纯化的实验方案。
根瘤菌（蓝色）侵染的根瘤器官
=======结果======
1. 根瘤原生质体制备及单细胞图谱构建
制备完根瘤原生质体，共收集获得超过 18000 个根瘤细胞用于后续单细胞转录组测序和分析。经过数据过滤，共获得 9756 个根瘤细胞 22228 个基因的表达数据。在无监督分析条件下，根瘤细胞被分为 13 个细胞类群，包括 2 类顶端分生细胞（NA1 和 NA2），侵染前细胞（PI），侵染细胞（IF），2 类固氮细胞（NF1 和 NF2），根瘤薄壁细胞（NP），2 类非侵染细胞（UiC1 和 UiC2），维管相关细胞（VA），2 类未知功能细胞（UN1 和 UN2），以及混合无定义细胞（MIX）（如下图C所示）。
上面聚类图中用到的marker基因如下图所示。
为了进一步了解这些细胞簇的特性，作者紧接着将 scRNA-seq 数据与根瘤激光捕获显微切割技术（LCM）介导的批量转录组测序（Bulk RNA-seq）数据进行比较，下图中highlight了top 50的marker基因，然后发现标记基因的上下调趋势一致，这些数据的一致性也表明了作者对细胞簇的注释是非常合适的。
2. 构建定型根瘤的物理细胞图
为了进一步研究这些细胞簇的物理位置，作者利用各个细胞类群特异性表达的标记基因构建 promoter:GUS 报告系统，结果均表明分生细胞 NA1 和 NA2 主要位于根瘤顶端分生区，共生类型细胞中侵染前细胞 PI 和侵染细胞 IF 主要位于侵染区，NF1 主要位于中间区和固氮区，NF2 主要位于固氮区；非共生细胞类型中薄壁细胞 NP 主要位于根瘤中央区外周尤其是顶端区域，非侵染细胞 UiC1 和 UiC2 主要镶嵌在根瘤中央区共生细胞类型之间，维管相关细胞 VA 主要位于外周呈束状环抱根瘤中央区。
3. 共生和非共生细胞的分化轨迹重建
为了进一步了解不同的根瘤细胞群是如何组织和相互连接的，作者进行了拟时序分析。首先使用 Monocle2 算法对共生和非共生细胞群进行了可视化分析，选取 Na2、PI、IF 和 NF1 分析共生群并指定 Na2 作为拟时间的开始。紧接着，作者采取 Monocle3 算法进行了验证，通过拟时序分析发现，共生类型细胞和非共生类型细胞分别从两类顶端分生细胞出发沿不同的轨迹分化。
4. 每个细胞簇的功能分析
从每个cluster specific的GO结果可以看出：NA1：黄酮类代谢；NA2：branched-chain amino acid(AA)；PI/IF：nodulation等。
5、不同黄酮类化合物的合成和代谢在共生和非共生细胞中功能分析
类黄酮在结瘤过程中发挥着各种关键作用。例如它们作为根瘤菌中nod因子合成的诱导物，调节宿主特异性，并抑制生长素运输等。所以，作者对黄酮类物质合成途径关键基因、氨基酸合成及转运途径关键基因的表达模式进行分析，发现根瘤细胞高度异质，不同细胞类群可能承担着不同的生物学功能。尤其是氨基酸合成途径，氮同化产物谷氨酰胺主要在固氮细胞 NF2 中合成，而植物利用氮素主要以天冬酰胺形式储存和转运，天冬酰胺则主要在非侵染细胞 UiC2 中合成；因此，非侵染细胞分担了根瘤氮同化生产线中的重要一环。
6. UiC2是天冬酰胺的主要合成位点
根瘤的核心生物功能是将大气氮转化为氨以供进一步利用，AA生物合成和运输过程是整个生产线的重要组成部分。一般情况下，固氮酶催化类是固氮的第一步，转化的NH4+被谷氨酰胺合成酶（GS）/谷氨酸合成酶（GOGAT）循环同化为谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）。所以作者接着查看了GS以及GOGAT相关基因的表达情况，发现Gln is the major nitrogen assimilation product in NF2, while Glu is synthesized more in UiC2。
7. AA在根瘤中的合成也呈现细胞类型特异性选择
AA的代谢与其运输是密切相关的。然而，根瘤是运输这些合成的氨基酸，如Gln和Asn，还未知。所以作者又查看了AA运输相关的基因的表达情况。结果发现，不同的transporter呈现细胞类型特异性选择，如下图所示，作者给出了一个总结模型来描述不同transporter选择的细胞类型。
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