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Westen Blotting常遇到的一些问题及解决方法

Westen Blotting常遇到的一些问题及解决方法

作者: AbMole生物 | 来源:发表于2018-12-11 12:44 被阅读49次

    Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

    实验流程

    提取与处理样品蛋白 —— 电泳分离样品蛋白 —— 转移蛋白至杂交膜 —— 封闭非特异性位点 —— 一抗孵育 —— 洗涤 —— 二抗孵育 —— 洗涤 —— 底物显色或曝光检测

    常见问题及解决方法

    Q&A

    无信号(白板)/弱信号(不是白板胜似白板)

    1. 样品

    ✦ 样品中无目的蛋白或目的蛋白降解——

    (1)设立阳性对照(2)检查封闭液是否有蛋白(3)使用蛋白酶抑制剂

    ✦ 上样量不够或蛋白表达丰度较低———

    (1)增加上样量(2)浓缩纯化样品

    2. 转膜

    ✦ 转膜不完全——(1)转膜后使用丽春红染色(2)使用蛋白质Marker

    ✦ 洗涤过度——减少洗涤时间和次数

    3. 封闭

    ✦ 封闭过度——(1)减少封闭液浓度及封闭时间(2)更换封闭时间

    4. 抗体孵育和检测头

    ✦ 抗体浓度和检测时间不够——(1)增加抗体浓度(2)延长孵育时间

    ✦ 一抗不工作——设置阳性对照

    ✦ 二抗不工作——和其他一抗配合检测二抗是否工作

    ✦ 一抗/二抗不匹配——检查抗体的来源和亚型,正确选择二抗

    ✦ 底物失活或灵敏度低——(1)重新配置有效底物(2)更换高灵敏度底物

    Q&A

    高背景(黑板或几近黑板)

    1. 封闭

    ✦ 封闭时间不够——延长封闭时间

    ✦ 封闭液和抗体有交叉反应——

    (1)更换封闭液,优化封闭试剂的类型和浓度 (2)加Tween-20减少交叉反应

    ✦ 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭液——推荐BSA封闭

    2. 抗体孵育和检测

    ✦ 一抗/二抗浓度太高——降低抗体浓度(主要是二抗)

    ✦ 孵育温度太高——建议4度孵育过夜

    3. 其他

    ✦ 洗膜不充分——5*3 mins,多次短时间洗膜

    ✦ 曝光时间过长——缩短曝光时间

    ✦ 出现干膜现象——保证膜充分浸透,避免出现干膜

    ✦ 二抗非特异性——设置只加二抗对照

    Q&A

    非特异性条带(杂带)

    1. 样品制备

    ✦ 二聚体或多聚体——还原变性电泳

    ✦ 蛋白不同剪切体——实验论证

    ✦ 蛋白降解——(1)使用新鲜样品(2)加蛋白酶抑制剂

    ✦ 上样量过大——减少上样量

    2. 封闭

    ✦ 封闭不充分——优化封闭时间和浓度

    3. 抗体孵育和检测

    ✦ 一抗/二抗浓度太高——降低抗体浓度(主要是一抗)

    ✦ 抗体没有经过纯化——纯化或更换抗体

    ✦ 二抗非特异性结合——使用二抗对照

    4. 其他

    ✦ 洗膜保证充分

    Q&A

    脏带(操作),补丁染色

    ✦ 脏带(操作问题)——(1)戴手套(2)用平头镊子(3)避免折叠、刮擦、膜的粘贴

    ✦ 补丁染色——(1)一抗浓度不够:增加一抗浓度(2)抗体孵育不均匀:摇床(3)干膜:保持湿润(4)细菌污染:加防腐剂或更换抗体;配制新鲜缓冲液

    Q&A

    表情条带(微笑,皱眉等)

    ✦ 微笑条带:主要由于凝胶中部聚合不完全,多见于较厚凝胶,也可由于上样量过大——室温静置充分凝固;调节上样量

    ✦ 皱眉条带:凝胶和玻璃挡板底部有气泡或凝胶两边聚合不完全或上样量过大——在两板间加入适量缓冲液;完全凝胶;重新配胶;调整上样量

    Q&A

    闹鬼(鬼带,鬼影)

    ✦ “鬼带”:大分子构象复杂蛋白质分子未完全变性或轻微复性;高含量高纯度蛋白存在 ——(1)加热煮沸后,再添加适量的DTT或Bate巯基乙醇,补充不足的还原剂(2)加适量EDTA阻止还原剂的氧化(3)分离或过滤样品

    ✦ “鬼影”(条带中心透亮):上样量过大,目的蛋白过多——适当减少上样

    Q&A

    碰到的其他问题

    ✦ 溴酚蓝不能起到指示作用(溴酚蓝已跑出板底,蛋白质却还未跑下来):主要与缓冲液和分离胶浓度有关——更换正确pH的Buffer;降低分离胶浓度

    ✦ 较粗条带:样品浓缩不佳或上样量过大——适当增加浓缩胶长度;保证浓缩胶pH 6.7;适当降低电压;减少上样量

    ✦ 电泳电压很高而电流却很低:电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:内外槽装反外槽液过少;电泳槽底部的绝缘体未去掉;上样孔中过多气泡——正确装配电泳槽;增加电泳液;以电泳缓冲液赶走气泡

    ✦ 浓缩胶与分离胶断裂:拔梳子用力不均匀或过猛;封闭下胶的水或正丁醇未弃净——温柔拔梳;弃净上胶部液体;重新配胶

    ✦ 板间气泡:解除制胶夹后板未夹紧而致空气进入;解除制胶夹用力过大——温柔并正确操作;气泡大时重新配胶

    ✦ 样品被蛋白酶降解/样品磷酸化:添加蛋白酶抑制剂Cocktail/磷酸酶抑制剂Cocktail,所有操作保持4℃以下冰上操作,并防止冻融

    希望今天的文章能对您的实验有所帮助。如果你还有什么想要了解的实验技巧,前沿研究,或者你有在实验过程中需要什么生化试剂,都不要犹豫来戳AbMole吧~

    此文章为 AbMole生物 原创,特此声明!

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