参考：https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/literature/microbial-genome-assembly-workflow-cn.pdf
对于nanopore 官网上面对于微生物基因组组装，建议加以使用第三方从头组装工具flye，另外再使用Racon和Medaka各进行一轮校正
Racon的使用
racon是一款用于基因组纠错的软件，既可以用于三代数据也可以用于二代数据的纠错。racon的运行速度比较快。racon既可以用于nanopore拼接结果，也可以用于pacbio数据拼接结果。此外，软件中还可以提供了一个racon_wrapper.py脚本，可以对输入文件进行拆分，提高运行效率。软件的使用也非常简单，输入数据需要三个，首先是contig，然后是测序的reads，以及前面二者比对的结果，这个比对结果可以是MHAP，PAF，SAM等三种格式当中的一种即可。数据结果为纠错后的contig序列。一般racon纠错也可以进行多轮。
- 使用案例
racon的使用比较简单，只需要输入需要纠错的基因组序列以及原始测序数据即可，软件主要有三个重要选项：
1 sequences ：测序数据，fasta或者fastq格式
2 overlaps ：比对后的结果，MHAP/PAF/SAM格式
3 target sequences：需要纠错的序列，fasta或者fastq格式
下面我们来具体演示一下racon的三轮纠错，并不是非得三轮，也可以2轮，也可以4轮，看具体情况，需要注意的是，下一轮中使用的输入文件，为上一轮的结果，不要搞混了。
(base) qianwj@ubuntu-NF5280M5:~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/1.1_error_correction $ minimap2 -t 4 ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/1_assembly/barcode01/barcode01_assembly.fasta ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/pass/barcode01/barcode01.fastq.gz > round_1.paf
第一轮纠错
conda activate base
racon -t 4 ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/pass/barcode01/barcode01.fastq.gz round_1.paf ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/1_assembly/barcode01/barcode01_assembly.fasta > racon_round1.fasta
第二轮纠错
(nanopack) qianwj@ubuntu-NF5280M5:~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/1.1_error_correction $ minimap2 -t 4 racon_round1.fasta ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/pass/barcode01/barcode01.fastq.gz > round_2.paf
(base) qianwj@ubuntu-NF5280M5:~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/1.1_error_correction $ racon -t 4 ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/pass/barcode01/barcode01.fastq.gz round_2.paf racon_round1.fasta > racon_round2.fasta
第三轮纠错
(nanopack) qianwj@ubuntu-NF5280M5:~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/1.1_error_correction $ minimap2 -t 4 racon_round2.fasta ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/pass/barcode01/barcode01.fastq.gz > round_3.paf
(base) qianwj@ubuntu-NF5280M5:~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/1.1_error_correction $ racon -t 4 ~/project/ONT/2021_12_16_multi_sample_basecalling_gpu/pass/barcode01/barcode01.fastq.gz round_3.paf racon_round2.fasta > racon_round3.fasta
medaka
medaka是nanpore官方出的一款工具（这又是什么鱼，不知味道如何），它是一个基于叠加序列的一致性序列修正工具。Medaka 现可以用于变体识别（variant calling）。使用纳米孔R9.4.1版芯片和最佳的工具，现在你可以进行SNPs识别，获得99%准确率。例如，使用当前的R9.4.1 版纳米孔，利用Flip-flop碱基识别器和Medaka, 测序金黄色葡萄球菌（S.aureus）基因组，准确现达到Q44，其它的小型基因组准确率约 Q40。注意，这里面所讲的Q40并不是测序过程中Phred质量体系的Q40，目前已经很多人被这个地方给迷惑了。
软件官网：https://github.com/nanoporetech/medaka
软件安装：推荐使用bioconda
- Medaka安装:
conda create -n medaka -c conda-forge -c bioconda -y medaka
- 软件特色
由Oxford Nanopore开发的开源软件
仅需使用.fasta或.fastq数据
速度比Nanopolish快50倍，支持CPU和GPU
通常在Pomoxis组装后使用
用FASTQ文档和组装结果作为输入文件
50X5Mbase 基因组用时20分钟
在Racon基础上，进一步提升了数据准确率
可针对不同数据进行个性化纠错方法训练
兼容Linux和MacOS系统
使用案例
软件的使用非常容易，只需输入要优化的基因组以及原始测序数据即可。软件会自动调用minimap2进行比对。
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