今天跟大家分享的是十月份发表在frontiers in Oncology杂志上的一篇文章，该文章通过分析乳腺癌(BC)患者外周血单核细胞(PBMCs，包括淋巴细胞和单核细胞)的转录组数据，来揭示宿主对BC全身免疫应答的异质性。
Two Distinct Subtypes Revealed in Blood Transcriptome of Breast Cancer Patients With an Unsupervised Analysis
对乳腺癌患者的外周血转录组数据进行无监督分析识别出两种不同亚型
数据和方法
数据：研究所用集数据来自南京医科大学第一附属医院的33名BC患者，在临床治疗之前进行外周血样本的采集，并进行RNA测序；验证数据集下载自European Genome-phenome Archive (accession number: EGAD00010001063)包括173名BC患者。
方法：首先，对两个集合的RNA-seq数据用DESeq2中的GLM做差异基因表达分析，FC<0.25 or >4.0并且FDR<0.01的定义为差异表达基因(DEGs)；然后，用Metascape和Reactome对DEGs进行注释和富集分析，保留P < 1×10−5的GO Terms、KEGG和Reactome通路。
亚型识别：该研究使用无监督的一致性聚类方法，分别识别观察集和验证集中的PBMC亚型。首先用根据绝对中位差选取前5000个基因用于后续分析，然后对PBMC表达谱的80%样本和80%的基因进行10000次重采样，基于Spearman距离做凝聚层次聚类，簇数定义为2-10，选择最优值；此外，作者还用分组比例(IGP)统计分析评估了聚类的可重现性。
免疫细胞丰度估计：研究使用CIBERSORT和LM22特征基因矩阵，分析了两个群组中每个BC患者PBMC样本的7种主要免疫细胞的比例(淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树状突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞)。
生存分析：研究基于PBMC样本数据识别出了免疫相关的基因特征，并用Kaplan-Meier-plotter对其做了生存分析。为了比较不同簇之间的临床特征、细胞比例和已有亚型，作者对分类变量做了Fisher’s精确检验或Pearson’s卡方检验，对连续变量做了Student’s t-test。
结果
临床特征不能解释BC患者外周血表达异质性
作者根据ER, PR和HER2三种免疫组织化学标记的状态将BC患者进行分类，并比较了它们之间的表达值，结果未发现显著差异，表明已有的临床分类不能解释BC患者PBMC表达的异质性。
BC患者PBMC转录组亚型的识别与验证
作者对观察集中筛选出的5000个基因的表达值进行无监督的一致性聚类，将患者分成了两种亚型subtype_1和subtype_2(图1.A和C，分别对应观察集和验证集)。图1.B是簇数分别取值2-10时，累积分布函数曲线下面积的相对变化，可知k=2为最优值。
图1. PBMC转录组亚型的无监督一致性聚类
接下来，作者用DESeq2对两种亚型进行了差异表达基因分析，在观察集中获得了1,988个DEGs，图2是对这些差异基因进行富集后，选取出的最显著的前20个免疫相关的GO功能类以及KEGG和Reactome通路。结果表明，这两种亚型之间的主要差异可能在于对BC的不同免疫应答。
图2. PBMC亚型有不同的分子途径和免疫应答模式
不同亚型免疫细胞丰度存在差异
由表1可知两个PBMC转录组亚型间淋巴细胞和中性粒细胞的占比存在显著差异(p值远远小于0.01)，而且两种亚型的中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)也显著差异。
表1. 分析集和验证集中不同亚型免疫细胞丰度的差异显著性
此外，作者评估了不同PBMC转录组亚型的患者肿瘤组织中TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的差异，发现两种PBMC亚型的BC患者记忆B细胞的肿瘤浸润存在统计学差异(图4)。
图4.两种PBMC亚型TIL差异的热图
PBMC转录组亚型可能与BC生存有关
NLR是评价机体炎症水平的指标，由于该指标在两种亚型间存在显著差异，故作者分析了不同PBMC亚型患者的存活率。KEGG富集最显著的通路是破骨细胞分化，富集到该通路的28个基因被识别出来，它们在subtype_2中的表达值均高于subtype_1(图5)。通过Kaplan-Meier-plotter，研究发现这一28-gene特征可以预测所有亚型的结果(图6)，基因表达值越高，患者存活率越高。在Reactome通路富集中，作者也识别出了与之类似的16个免疫相关的基因。
图5. 28个免疫signature基因在两个亚型中的表达情况
图6.用28-gene特征分层的KM曲线
总的来说，本文基于乳腺癌患者的PBMC表达谱数据识别出了两种新的亚型，它们之间的免疫细胞丰度存在显著差异，因此具有不同的免疫模式。此外，生存分析表明这两种亚型的临床结果也不同。整个文章思路清晰，而且简单易操作，小编就为您解读到这了！
今天，跟大家分享的一句话是：In order to be successful, one must project an image of success at all times.
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