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影响因子：7.3
目的：根据铂耐药性相关（PRR）基因分析，识别分子亚型，并开发膀胱癌（BLCA）肿瘤免疫微环境（BLCA）的评分系统，同时确定P4HB作为潜在的治疗靶点。
方法：作者分析了594个BLCA样本的基因表达数据和临床信息，使用无监督聚类来根据PRR基因的表达水平来识别分子亚型，进行了功能和通路富集分析，以了解这些亚型的生物活性。评估了TIME，并开发了预后签名和评分系统。此外，作者分析了免疫检查点抑制剂的功效，进行了实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）实验，以检测BLCA细胞系中脯氨酸4-羟化酶亚基β（P4HB）的表达水平。在5637和EJ细胞中进行了小干扰核糖核酸（siRNA）的转染，以击倒P4HB，并通过伤口愈合和转井分析评估P4HB对细胞功能的影响。最后，在顺铂耐药性T24细胞中对P4HB进行siRNA转染，以评估其对BLCA对铂基化疗药物敏感性的影响。
结论：研究表明，PRR特征与临床病理特征、时间特征和预后特征显著相关。关键的PRR基因P4HB是BLCA患者个性化治疗的生物标志物。
在筛选到基因后，可以后续接上肿瘤分型或者机器学习之类的方法，进一步丰富文章内容。
研究结果：
一、 BLCA中PRR签名的遗传特征
将TCGA和GEO数据库中的BLCA表达基因与HGSOC-Platinum数据库中的PRR基因相交，获得了846个与BLCA相关的PRR基因（图1A）。筛选了具有显著预后相关性（n=22，p<0.001）的PRR基因的相互作用和调节关系网络，并通过框图可视化了正常组织和肿瘤组织之间差异表达（n=16）的表达（图1C）。
二、BLCA中PRR分子亚型的鉴定
对594个样本中264个PRR基因（cox p<0.05）的表达进行了无监督聚类分析，当k=3时，共识聚类最合适，确定了三个分子亚型并命名为集群A-C（图2A-C）。A组包含237例，B组包含174例，C组包含183例。热图显示了三种分子亚型与临床特征之间的关系，包括TNN阶段、等级和年龄（图2D）。
此外，根据热图数据，三种分子亚型之间的PRR基因表达水平明显不同，与其他两种亚型相比，C簇受到高度下调。PCA确认了三种独特的PRR分子亚型（图2E）。如K-M曲线所示，三种PRR分子亚型具有不同的预后，C簇具有明显的预后优势（图2F）。此外，集群A和B表现出比集群C更多的肌肉免疫细胞浸润（图2G）。
三、PPR基因的功能富集分析
不同分析之间进行差异分析获取差异基因，使用GO功能富集分析（图3A），作者发现TME的改变，特别是免疫系统过程、细胞外基质和细胞-细胞粘附的调节，是PRR分子亚型异质性的主要原因。作为KEGG分析的结果（图3B），发现了与分子亚型和BLCA相关的各种生物过程和信号通路，PI3K-Akt途径、NF-B途径、Toll样受体途径和TNF途径在BLCA中丰富。此外，用于IgA合成的肠道免疫网络、细胞因子-细胞因子受体连接和细胞粘附分子都与TIME浸润有关。
四、BLCA中耐铂DEGs的综合分析
对DEGs进行了聚类分析。结果与PRR分子亚型相似，确定了三种名为基因簇A-C的基因-分子亚型，可以根据DEG的表达水平明确区分。C组患者的预后明显优于A和B组，免疫细胞浸润明显低于其他两个簇。
五、PRR评分系统的开发
通过单基因回归分析，多因素回归分析，lasso回归，最终基于7个基因构建了PRR评分系统。将BLCA患者分为高PRR评分组和低PRR评分组。通过结合7个PRR基因的危害比和表达热图，发现高分组中，危害比为1的基因的表达水平更高，如醛脱氢酶2C4（ALDH1A）、脱糖蛋白1（DSG1）、低密度脂蛋白受体（LDLR）、神经皮林2（NRP2）和P4HB。相比之下，危险比为1的基因，如干扰素γ（IFNG）和白细胞介素17A（IL17A），在低评分组中表达得更高（图4A）。此外，PRR分子亚型和评分系统之间存在显著的相关性。具体来说，PRR簇C和PRR基因簇C与低分显著相关，而A和B簇则表现出相反的趋势（图4C-D）。作者可视化PRR簇、基因簇、PRR评分和生存状态之间的关系（图4B），PRR评分与临床病理特征之间的关系（图4E-H）。
生存分析表明，PRR评分高的BLCA患者的生存率明显低于PRR评分低的患者（图5A-B）。作为患者1年、3年和5年生存率的单一预测指标的PRR评分显示ROC分别为0.720、0.697和0.705（图5C）。此外，单变量和多变量Cox比例危害回归分析显示，年龄（HR=2.269，95%CI=1.70−3.029，p < 0.001），T阶段（HR=1.585，95%CI=1.237−2.032，p < 0.001），N阶段（HR=1.498，95%CI=1.234−1.818，p < 0.001）和PRR评分（HR=1.100，95%CI=1.066−1.1351.0，p < 0.001）是BLCA的重要独立预测因素（图5D-E）。根据这些独立的预后因素，作者为BLCA构建了一个预后模型（图5F）。该模型在预测BLCA的1年、3年和5年生存率方面比单因素PRR评分更准确，AUC分别为0.792、0.796和0.824（图5G）。此外，校准曲线显示实际观测和计算概率之间存在良好的一致性（图5G）。
将患者以1:1的比例随机分为训练和测试队列，以评估PRR评分系统的可靠性和有效性。研究发现，关键的PRR基因表达特征在训练和测试队列之间是一致的（图6A）。在训练和测试队列中都显示了BLCA患者的PRR评分和生存状态之间的负相关性（图6B-C）。K-M生存曲线表明各组之间存在显著差异。在所有队列中都观察到更高的死亡率和更短的生存时间（图6D）。计算了1年、3年和5年生存率的AUC值，发现所有队列中都很高（图6E）。
六、PRR评分系统与免疫微环境之间的关系
CIBERSORT分析发现，PRR评分与M0巨噬细胞、肥大细胞休息和分化集群4+（CD4+）记忆T细胞休息之间存在显著的正相关性。相比之下，在PRR评分与自然杀伤力（NK）细胞、激活的CD4+记忆T细胞和分化8+（CD8+）T细胞的光泽之间观察到显著的负相关性（图7A-G）。在高PRR评分组中，免疫抑制细胞的丰度较高，这表明免疫抑制TME与预后不良一致。估算评分用于评估肿瘤组织中的免疫细胞浸润。结果表明，与低RPP评分组相比，高RPP评分组的ESTIMATE评分显著增加，这与CIBERSORT的结果一致（图7H）。作者生成了一个热图来研究PRR签名和免疫细胞之间的关系，风险因素（ALDH1A1、DSG1、LDLR、NRP2和P4HB）与M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、静止肥大细胞和中性粒细胞之间存在显著的正相关性。相比之下，有利因素（IFNG和IL17A）与M1巨噬细胞、静止的NK细胞、激活的CD4+记忆T细胞和CD8+ T细胞呈显著正相关（图7I）。
七、PRR评分系统与免疫治疗之间的关系
作者评估PRR评分系统与免疫检查点表达水平之间的联系。结果显示，PRR评分与大多数免疫检查点相关分子之间存在正关系，特别是CD274、程序性细胞死亡1配体2（PDCD1LG2）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）和淋巴细胞激活3（LAG3），这些分子在高PRR评分组中表现出明显更高的表达（图8A）。高分组中免疫检查点相关分子的上调表达提供了进一步的证据，证明在这些患者中观察到的预后不佳可能归因于免疫抑制性微环境。随后，探索了BLCA患者PRR评分系统与免疫治疗之间的关系。结果表明，无论免疫检查点分子CTLA-4和PD1表达如何，低PRR评分组对免疫治疗的反应都比高PRR评分组好得多（所有p<0.001；图8B）。作者分析了用抗PD-1/PD-L1治疗的转移性尿皮癌的IMvigor210队列进行的临床试验数据。与高PRR评分组相比，低PRR评分组与较高的免疫细胞（IC）2+比例（41%对28%）有关，并且观察到肿瘤细胞（TC）2+水平（16%对13%）的类似趋势（图8C-D），这再次证实了PRR签名和TIME之间的密切关系。图8E、F表明，与另一组相比，低PRR评分组与较高的完全缓解/部分缓解（CR/PR）比率（28%对17%）和较低的稳定疾病/进展性疾病（SD/PD）比率（72%对83%）有显著相关。此外，K-M曲线分析显示，低PRR评分组的预后比高PRR评分组更好（p=0.002；图8G）。
八、P4HB与BLCA进展和铂抗性
通过qPCR实验，与正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）相比，BLCA细胞系中P4HB的表达水平显著升高（图9A）。作者建立了一个用于P4HB敲除的siRNA转染模型，并通过qPCR实验确认了5637和EJ细胞的低效率（图9B）。5637和EJ细胞的P4HB表达降低，损害了细胞迁移能力（图9C）。此外，通过CCK8分析，与耐铂T24细胞相比，铂抗性T24细胞中的P4HB击倒降低了铂基化疗药物的一半最大抑制浓度（IC50）（图9D）。
研究总结：本研究中，作者通过分子亚型和评分系统研究铂耐药性相关（PRR）特征在肿瘤免疫微环境（TIME）中的作用和BLCA患者的预后特征。该研究表明，PRR分子亚型和评分系统与临床病理特征、TIME和预后特征显著相关，展现了它们作为BLCA患者个性化治疗的临床工具的潜力。
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