Ki67荧光染色

细胞Ki67染色，应该是核定位蛋白，却总是染色到胞质，尝试过很多方法，包括抗体稀释液全部用0.3%TritonX-100,未做封闭，延长4度条件下一抗孵育时间至48h，改用37度水浴孵育一抗....还是没有明显的改善，不知道怎么该处理。
现附上目前实验的步骤：
1、细胞用PBS清洗
2、4%多聚甲醛室温固定10min
3、PBS清洗5min3次
4、0.3%TritonX-100室温破膜30min
5、吸去多余的破膜液，孵一抗4度过夜（一抗是用0.3%TritonX-100稀释，Santa Cruz公司Ki67，1：200）
6、PBS清洗5min3次
7、0.3%TritonX-100稀释二抗，室温孵育2h
8、复染DAPI
9、PBS清洗5min*3次
10、甘油封片