禾谷镰刀菌中发现一个新的hypovirus病毒
禾谷镰刀菌中发现一个新的hypovirus病毒。
从禾谷镰刀菌JS16菌株中分离得到一个新的真菌病毒，Fusarium graminearum Hypovirus 2 (FgHV2/JS16)。它的基因组长12,800nts（不包含poly A尾巴），只有一个大的假定开放阅读框，编码多蛋白，包含3个常见功能域：papain-like蛋白酶（Prot）、RNA聚合酶（RdRp）和RNA解旋酶（Hel），以及一个与细菌SMC（structural maintenance of chromosomes）染色体分离蛋白同源的新结构域。在JS16菌株中还发现了一段缺陷RNA（defecting RNA；D-RNA。4553-nts，不包含poly A尾巴）片段。FgHV2编码蛋白的氨基酸序列与CHV1和CHV2的identities分别为16.8%和16.2%，多重比对的系统发育分析显示Hypoviridae科病毒被分为两类，FgHV2同CHV1，CHV2，FgHV1和SsHV2在一组。
试验发现FgHV2会造成真菌衰弱现象，real time RT-PCR结果显示FgHV2的存在激活了F. graminearum的RNA干扰途径。
试验操作内容
1. 真菌实验：JS16菌株的分离；用80-100μM的Ribavirin处理，得到不含病毒的菌株JS16-F；通过单孢纯化得到另一个不含有病毒的菌株JS16-F2.
2. 提取dsRNA，DNaseⅠ和S1 nuclease纯化dsRNA。
3. Northern blot证明D-RNA在JS16中的存在；验证真菌脱毒实验结果。
4. 克隆和测序
（1）由dsRNA生成cDNA（dN6）→Tag primer-PCR获得产物。将PCR产物用试剂盒纯化→纯化得到的DNA进行PMD 18-T载克隆→克隆载体转化到感受态细胞。用M13引物扩增序列→对得到的产物测序。得到的序列结果都是从至少四个不同克隆测序结果确认后得到的→DNAMAN分析序列→BLASTx。
（2）根据得到的结果序列设计特异性引物→进行PCR再测序→最终将遗失的序列都补齐。
（3）RACE（rapid amplification of cDNA ends），确定序列两端。
5. 序列和系统发育分析
序列拼接、ORFs核苷酸和氨基酸序列分析在DNAMAN软件上完成。可能的ORFs查找利用NCBI的ORF Finder tool。5‘端可能的结构预测用Mfold软件（version 2.3）。用MEGA建树。
6. 病毒对真菌的影响
对脱毒前后的真菌进行了菌丝生长，产孢，致病力，生物量，生物毒素产生的实验。
7. 定量PCR
选择编码cyclophilin1和elongationfactor 1α的基因为内参，9个检测基因，其中2个为argonaute-like基因，2个Dicer-like基因，5个RdRP-like基因。
结果
1. 菌株JS16中dsRNA的发现和测序
图1-A可以看到JS16和没有病毒的JS16-F菌落形态，图1-B是提取的dsRNA电泳图，JS16中有约为13kb和5kb大小的条带，将它们切下，纯化，克隆。通过127个用随机引物的克隆测序得到了L-dsRNA的全长，在通过设计特异性引物再次确认了序列。不算poly A的基因组全长为12,800nts；对于S-dsRNA同样，通过56个克隆获得，得知不算poly A的全长为4553nts。
图1，其中A是菌落对比；B是dsRNA凝胶电泳图；C中扩增模板是纯化的S-dsRNA条带，它的扩增结果和D-RNA的相同；D图是Northern blot，探针1和2针对的是FgHV2的5’和3’端，除了L-RNA和D-RNA没有别的亚基因组（subgenomic mRNAs；sgRNAs）；E为基因组示意图。
2. FgHV2的分子特征
L-dsRNA的gRNA示意图和D-RNA示意图如图1-E，其中引物P1-5的位置在示意图下有标注。L-dsRNA条带的基因组由一个长ORF和两端UTRs构成，ORF由起始密码子AUG（nt 位置458-460）开始，由终止密码子UAA（nt 位置12,290-12,292）终止，预计编码3944个氨基酸，446.2kDa。编码多蛋白区域包含三个常见蛋白产物，papain-like蛋白酶，RdRp和Hel，是Hypoviridae科病毒的保守结构域，5‘-UTR有茎环结构。将L-dsRNA条带表示的病毒命名为Fusarium graminearum hypovirus 2 (FgHV2/JS16)。通过碱基和氨基酸序列比对发现与ssRNA真菌病毒Hypoviridae相似，L-dsRNA片段是ssRNA病毒复制过程的一个存在形式。
3. FgHV2与其他hypoviruses的系统发育关系
对比分析了FgHV2和其他病毒中Prot，RdRp，Hel的氨基酸序列；全基因组序列，ORFB以及非编码区的nt序列。
4. FgHV2病毒对禾谷镰刀菌的影响
文章对比了有病毒和无病毒菌株的菌落大小，生长速率，生物量，产孢量，DON浓度，致病力（病穗数、病粒数）等。
5. 与PTGS机制相关的基因的表达
为了检测JS16菌株对FgHV2病毒入侵的反应，作者根据对比研究较多的C. parasitica的Dicer基因，Argonaute基因和RdRp基因序列，选择对9个禾谷镰刀菌中的PTGS相关基因进行荧光定量PCR，测定表达量的变化。与之前其他真菌研究结果类似，基因表达上调。
概念解释
PTGS：Post-transcriptional gene silencing转录后基因沉默
D-RNA：文章里dsRNA凝胶电泳图有两个条带，大的为L-RNA，是病毒完整基因组的大小，另一个S-RNA，就是缺陷病毒的条带，又叫做D-RNA。D-RNA和DI-RNA（defective interfering RNA）是subviral RNAs的表现形式，在很多RNA病毒中都发现了。它们常常与病毒RNA编码截断蛋白、缺陷蛋白区域或无编码蛋白区域有关。FgHV2的D-RNA结构与CHV3病毒D-RNA构想相似，一个主要ORF，5‘端部分包含一个蛋白酶基因，3’端部分包含解旋酶基因。我的真菌材料里，很多在500bp有条带，克隆之后发现是一个2000bp的病毒的一部分。CHV1病毒的研究文献里说D-RNAs的产生可能与寄主RNA沉默有关；RnPV2病毒的研究说DI-RNAs可以影响病毒的复制，降低病毒侵染的症状。我的材料里那个500bp的神秘缺陷RNA有时间可以研究一下。
PS. 最后感慨一下，如果不做单个菌株的深度测序，那么获得一个完整的病毒序列需要做好多克隆（文章里一共做了快200个）。
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Li, P., Zhang, H.,Chen, X., Qiu, D., and Guo, L. (2015) Molecular characterization of a novelhypovirus from the plant pathogenic fungus Fusarium graminearum. Virology 481: 151-160.
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