Tn5转座酶结构
Tn5转座子由编码三个抗性基因的核心序列（kan、ble、str）和两条倒置的IS50序列组成，其中IS50R和IS50L的序列高度同源，含有编码转座酶（TnP）以及转座阻遏蛋白（lnh）的基因，但IS50L的一个碱基存在突变导致翻译提前终止，因此只有IS50R可以产生正常的有活性的TnP和lnh。IS50具有19bp的倒置末端（外末端OE和内末端IE），两倒置末端有7个bp不同（如图Fig 3中加粗碱基），此倒置末端是转座酶（Tnp）的作用位点[1]。
Fig 1. Tn5酶结构.png
Fig 2. OE/IE/ME的序列及其差异
Tn5酶转座过程
Tn5酶转座过程
- 两个转座子酶（Tnp）与转座子末端OE末端结合，形成两个Tnp-OE复合体，随后两个复合体通过Tnp的C末端相互作用进行联会，形成Tn5转座复合体并具有切割DNA活性。
- 从供体DNA上脱离。Tnp将通过水解解作用切割OE的3'端，露出3'OH，即磷酸二酯主链被切开，3’-OH攻击其互补链的5’，从而形成发卡结构从供体DNA中脱离。发卡结构再通过水解作用形成3’OH。
- 接下来Tn5转座复合体将会切割目标DNA，并通过3'OH在目标链上进行亲核攻击、酯交换反应将转座子插入到目标DNA序列中。产生的9bp的粘性末端通过DNA聚合酶、连接酶作用进行填补，由此两端形成9bp正向重复序列[2]。
Note：Tnp结合和插入也有一定的偏好性，其首选的DNA靶序列是A-GNT（T/C）（A/T）（A/G）ANC-T，其中N是任何核苷酸[3]。
Fig3 Tn5转录过程.png
9bp重复的形成过程
Tn5转座复合体中两个OE末端的3’OH必须攻击相距9bp的两个磷酸二酯键，而两个3'OH相距41埃（一个光波的单位，1埃=1×10-10米），这个长度比正常双螺旋结构中9bp的稍远，因此两个3’OH将会镶嵌在一个DNA双螺旋（~10.5bp）的缝隙中，等待在DNA双螺旋在解链过程中，相隔9bp的两个磷酸二酯键恰好等于2个3’OH之间的距离，通过置换反应将转座子插入到目标DNA中，因此转座子两端将会有两个9bp的gap。此时这9bp的gap通过填补，由此两端形成9bp正向重复序列
ATAC-seq建库
研究人员发现，整个转座子序列并不是转座必须的，只需转座子的末端核心序列（OE/IE/ME，具体序列如图Fig 2），转座酶便能将该部分序列插入并连接至基因组内[4]；根据这个原理，将测序接头序列加入末端核心序列中，可简捷地引入测序接头，完成文库构建。传统建库方式需要经过DNA片段化、末端修复、接头连接、文库扩增、多次纯化分选等步骤，耗时较长，将Tn5用于测序文库构建时，可将DNA片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为1步反应，极大缩短建库时间，提高工作效率。
Fig 4. Tn5文库构建
scATAC-seq建库过程
以10X genomics为例。
- 细胞核悬浮液在包含转座酶的转座混合物中孵育。 转座酶进入细胞核并优先片段化染色质开放区域的DNA。同时，将接头序列添加到DNA片段的末端。
- 在微流控装置的作用下形成油包水结构，保证一个液滴中包含一个gel beads和一个细胞。
-
细胞中的DNA片段被gel beads上的方向互补序列捕获，由此便为每个细胞中的片段化染色质开放区域的DNA片段加上身份标签。通过PCR随后经过PCR富集便可完成单细胞ATAC-seq的建库。
Fig 5 10X scATAC-seq建库过程.png
- Goryshin, I.Y. and W.S. Reznikoff, Tn5 in vitro transposition. J Biol Chem, 1998. 273(13): p. 7367-74.
- Reznikoff, W.S., Tn5 as a model for understanding DNA transposition. Molecular Microbiology, 2003. 47: p. 1199–1206.
- Igor Y. Goryshin, J.A.M., Yuri V. Kil, Vladislav A. Lanzov, and William S. Reznikoff, Tn5/IS50 target recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998. 95: p. 0716-10721.
- Reznikoff, R.C.J.W.S., DNA sequences at the ends of transposon Tn5 required fot transposition. Nature, 1983. 304.
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