标题：Simple statistical identification and removal of contaminant sequences in marker-gene and metagenomics data
期刊：Microbiome
发表时间：2018-12-17

目的：

去除宏基因组测序（marker-gene and metagenomic sequencing）过程中引入的污染

背景：

1. 测序中的污染会影响样本多样性、模糊样本间差异、干扰不同研究之间的比较。
2. 在低生物量环境中（如血液，组织），污染会影响物种是否存在的结论；在高生物量环境中，污染占很大部分低丰度的物种。
3. 控制污染的措施：在DNA提取和PCR阶段引入阴性对照（试剂及空白取样装置）。
4. 通常，如果对照PCR无条带，则认为没污染，但是此方法不够灵敏。
5. 两种污染主要来源：外部来源，研究对象身体、实验室表面和空气、样本收集装置、实验试剂；内部来源：样本处理和测序过程中的交叉污染。
6. 三种常用去污染标准：（1）去除低于相对丰度阈值以下的物种；（2）去除阴性对照中出现的物种；（3）去除之前研究认为污染的物种（blacklist）

Decontam去污染潜原理：

1. 来自污染物种的序列可能具有与样本 DNA 浓度呈负相关的频率 （frequency/abundance-based）

• 引入两个线性模型，污染模型和非污染模型（log（frequency）~log（total DNA））。污染模型斜率为-1，非污染模型斜率为0
• 计算两个模型的残差平方和（RRS）之比R（污染模型/非污染模型）【思考：如果taxon为污染，污染模型的RRS趋近于0，R趋近于0；如果taxon为非污染，非污染模型RRS趋近于0，R值趋近无限大】
• 计算比例为R时的双尾概率P（0-1）。值越小，污染模型更好；值越大，非污染模型越好。

2. 来自污染物种的序列可能在对照样本中比在真实样本中具有更普遍 （prevalence-based）

• 计算taxon在对照和真实样本中的频率

• 卡方或Fisher精确检验计算P值

  
  image.png
  

  (污染DNA在不同样本中预期是一致地，低水平地)

【Decontam不能鉴定交叉污染 （SCRuB似乎可以，DOI：10.1038/s41587-023-01696-w）】

使用注意事项：

1. 批次效应：Decontam可以设置实验批次，不同批次之间单独计算score。根据不同批次的score选择阈值。

2.阈值：默认阈值为0.1.建议根据score分布进行阈值设置。

3.适用数据：ASVs，OTU，taxonomic groups， orthologous genes， MAGs或者其他相对丰度的特征值

4.输入要求：isContaminant鉴定污染，输入（1）相对丰度或者频数；（2）下列两者或两者之一

• 每个样本定量的DNA浓度（建库时可测定）
• 阴性对照样本
  【若只有其中一种，应只能使用一种方法（frequency-based or prevalence-based）进去去污】

5. 极低生物量样本：isNotContaminant鉴定非污染，只使用prevalence-based方法。但低Score和非污染相关，与isContaminant的Score含义相反。

结果：

Decontam 可分开可能的污染物和人类口腔真实存在的物种

Fig 2

• 对712个口腔样本，33个对照进行分析
• 某些taxon出现典型污染特征（frequency-based，如Seq3、Seq53、Seq152）；某些taxon呈现非污染特征（frequency-based，如Seq1、Seq12、Seq200）
• Score出现双峰模型。部分高Score的taxon鉴定为污染。

Decontam 区分准确性

Fig 3

• 手动根据文献建立两个数据集，真实存在口腔的物种（oral）和污染的物种（contaminant）
• 物种prevalence越高，decontam区分污染与非污染的能力越强（Fig 3a）
• decontam对高丰度和高频数的taxon可以进行有效区分。这些taxon对下游分析有很大影响。

Decontam应用于稀释数据集

Salmonella bongori单一培养，六次十倍连续稀释，用于16S rRNA和shotgun宏基因组测序。

Fig 4
Fig 5

• 使用独立batach去污染，效果比所有样本混在一起效果更好
• 阈值越大，去污染灵敏度越高
• 去污染可以降低技术误差

Decontam应用于低生物量环境

image.png

• 使用isNotContaminant进行去污染
• 前六的非污染序列（存在>5样本），五个是human
• 无法确定另外一个的真实性

减少妊娠微生物群与早产之间的假阳性关联

Fig 6

• 探究阴道微生物和早产之间的关联
• decontam区分污染
• 部分之前研究认为强关联的物种被区分为污染

建议：

方法选择

• frequency-based method需要DNA浓度信息
• prevalence-based method需要阴性对照样本，但少量对照样本会影响区分
• isContaminant采用combined method更佳
• 低生物量环境采用isNotContaminant更好

区分阈值

• 默认0.1
• 最贪婪0.5
• 根据Score分布进行选择

特征选择

• Marker-gene数据，ASVs比OTU更佳，避免将污染聚在同一个Unit
• 宏基因组中，低水平的分类组更佳，如species优于family，基因优于通路