鉴定驱动浸润性癌症形成的基因和通路一直是许多大规模基因组学工作的核心焦点，但目前大多数研究都集中在晚期肿瘤的批量分析上，而在很大程度上忽略了癌前病变。因此，从正常到癌前病变再到癌变状态的转变过程中发生的表型变化的进展以及这种转变的分子驱动因素仍不清晰。
2022年6月20日，美国斯坦福大学医学院William J. Greenleaf教授团队在Nature genetics杂志上发表了题为 Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer 的文章，研究人员通过单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）和单细胞核转录组测序（snRNA-seq）对48个息肉、27个正常组织和6个结直肠癌样本进行了分析，结果揭示了肿瘤干细胞从稳态发展到结直肠癌时发生的表观遗传和转录变化特征，绘制了健康结肠变为癌前腺瘤再到结直肠癌 （CRC） 转化过程中发生的细胞组成和细胞状态变化图谱。
01 绘制恶性转化过程中的细胞图谱
研究人员收集了来自 8 个家族性腺瘤性息肉病（FAP ）和 7 个非 FAP 供体的 81 个样本，对每个组织都进行了匹配的 scATAC-seq 和 snRNA-seq。聚类分析发现，基质细胞和免疫细胞通常聚集在一起，而上皮细胞则相对分离。
02 T细胞和髓系细胞在息肉和CRC中富集
通过细胞注释和染色质活性评分，研究人员鉴定到了一群耗竭 T 细胞，对 CD3 和 PD1 进行了 CODEX 成像，发现 8 个息肉的 PD1 表达较低或检测不到，但在两个 CRC 样本中都发现了 PD1 表达，说明仅在 CRC 中发生 T 细胞耗竭。另外还观察到一组几乎完全富集于CRC的癌症相关成纤维细胞 （CAF），以及一群富集于息肉和 CRC 中的成纤维细胞群（与 CAF 相同的基因具有可及性），定义为癌前相关成纤维细胞 （preCAF）。这些观察结果表明，息肉和肿瘤中存在表型不同的成纤维细胞，因此可能在癌前病变的肿瘤发生中发挥作用。
03 scATAC 揭示了 preCAF特征
CAFs 的重要特征基因是FAP、VCAN和COL1A2，CAFs 对这些基因的特异性表达表明成纤维细胞参与癌组织中独特的细胞外基质重塑，这在正常结肠或癌前息肉中不会发生。scATAC 分析显示 CAFs 和 preCAFs 在WNT2TSS处表现出最大的可及性，表明染色质的变化促进了 CAFs 和 preCAFs 中WNT2的表达。此外， CAFs 的可及性与 preCAFs 的相关性最高，这突出了 CAFs 和 preCAFs 之间的相似之处，并表明 preCAFs 可能执行与 CAFs 类似的功能。
04 RUNX1 与 CAFs 的广泛可及性相关
研究人员发现， JUN/FOS 和 CEBP 基序的 CAF 标记峰富集，JUN/FOS 和 FOX 基序的 preCAF 标记峰富集，具有相似基序的 RUNX1 和 RUNX2 的染色质活性水平在 CAFs 和 preCAFs 中最高。然而，RUNX1 主要在 CAFs 和 preCAFs 中表达，而 RUNX2 在 CAFs 中的表达要低得多，这表明RUNX1在CAFs中对RUNX基序的可及性的驱动作用强于RUNX2。
05 干细胞样上皮细胞富集于息肉中
研究人员对来自无FAP患者收集的正常上皮结肠细胞组成的RNA-seq和ATAC-seq数据进行分析。通过分化轨迹投射和干细胞评分发现源自息肉和结直肠癌样本的细胞富含干细胞样上皮细胞，而成熟肠细胞则耗尽，这表明上皮细胞在从正常细胞到息肉的转化过程中越来越多地表现出干细胞样表型，研究人员推测息肉和结直肠癌中的干细胞样细胞群可能代表这些组织中的“癌症”干细胞。
06 干细胞样细胞形成潜在的恶性肿瘤连续体
接着研究人员将息肉和结直肠癌干细胞样细胞的基因表达和染色质可及性与正常干细胞进行比较，分析表明正常干细胞与这些干细胞样息肉细胞之间基因表达和染色质可及性的差异遵循从早期到晚期息肉再到侵袭性结直肠癌的固定进展，并且确定了该连续体特定存在于干细胞样细胞中。
07 基因表达沿恶性连续体的变化
研究人员使用所有未受影响的样本进行差异分析，观察到显著差异峰和基因的绝对数量沿着恶性肿瘤连续体逐渐增加，其中腺癌样本表现出最多的差异峰和基因。然后通过选择在至少两个样本中差异表达的基因，将这些基因聚类并检查了沿该恶性肿瘤连续体的基因表达变化，发现了从正常结肠到癌症的转变过程中表达逐渐增加/减少的基因和恶性转化特异性基因，如ASCL2、HNF4A等。
08 沿恶性连续体重塑细胞组成
研究人员计算了每种细胞类型对每个样本的贡献分数作为恶性肿瘤连续体中位置的函数，发现某些细胞类型与恶性肿瘤连续体的进展高度相关：在整个恶性转化过程中，样本中干细胞的比例逐渐增加，成熟肠细胞的数量减少；许多息肉中未成熟杯状细胞的分数增加，而在肿瘤中，普遍缺乏向分泌谱系的分化，有效地消除了杯状细胞。
另外，在上皮细胞之外还观察到从未受影响的息肉再到癌的转化过程中细胞组成的变化：基质细胞方面，preCAFs的比例逐渐增加，而CAFs仅出现在CRCs中；免疫细胞方面，恶性息肉和结直肠癌中的调节性T细胞（Tregs）增加，而耗竭性T细胞仅出现在结直肠癌中。Tregs的逐渐增加可能是癌前息肉免疫逃避的一种机制。这些结果说明基质细胞和上皮细胞之间沿恶性连续体之间可能存在细胞间相互作用。
09 DNA甲基化变化与染色质可及性比较
异常的DNA甲基化是结直肠癌肿瘤发生的主要机制。研究人员绘制了整个恶性肿瘤连续体中与高甲基化和低甲基化探针重叠的差异峰数，发现CRCs的最终差异甲基化的区域发生的染色质可及性变化在从正常到癌症的过程中积累，在晚期息肉和CRCs中观察到的数量最多。与高甲基化探针重叠的差异峰最接近的基因是NR5A2。NR5A2 的高甲基化、可及性降低和基因表达降低表明，NR5A2 缺失可能引发的促炎状态可能在肿瘤发生中起作用。
结论和意义
本研究对癌前上皮细胞的组成和细胞状态的分析表明，随着息肉接近恶性肿瘤，越来越多的上皮细胞呈现干细胞样状态，这些细胞表现出与正常干细胞不同的潜在功能失调的表观遗传和基因表达程序。另外，研究还确定了非癌细胞（包括成纤维细胞和免疫细胞）的组成和细胞状态变化，这些变化可能会影响肿瘤微环境以驱动癌症进展。该研究填补了癌前病变研究的空白，并为恶性肿瘤的预防、诊断和治疗提供了丰富的潜在靶点。
参考文献：
Becker WR, Nevins SA, Chen DC, Chiu R, Horning AM, Guha TK, Laquindanum R, Mills M, Chaib H, Ladabaum U, Longacre T, Shen J, Esplin ED, Kundaje A, Ford JM, Curtis C, Snyder MP, Greenleaf WJ. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 2022 Jul;54(7):985-995. doi: 10.1038/s41588-022-01088-x. Epub 2022 Jun 20. PMID: 35726067; PMCID: PMC9279149.
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