凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可用于（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
我使用的是thermo的EMSA试剂盒，也用过国产的碧云天的试剂盒。个人觉得二者差异并不大。试剂盒会提供详细的步骤，以下是根据个人实验的经验有所改动，仅供参考。
1.提前配置6%的非变性胶，凝胶时间略微长一点，防止胶凝固不好，影响点样。可以直接合成带Biotin标签的探针，方便使用，无需再给探针加标记。
2．预电泳：冰上，100v，30-60min，在预电泳过程中配置如下表结合反应，加入探针之前先混匀反应液，室温静置10min，加入探针后再静置20min。具体反应根据说明书和自己实验调整。
3. 加入5μl 5×Loding Buffer，轻柔上下吹匀，不可剧烈混匀
4. 电泳：冰上，100V电泳30-40min，溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳
5. 将尼龙膜剪成与蛋白胶大小相同或稍小，剪角做标记，浸于0.5×TBE，至少10min。
6. 用冷却至4°C的0.5×TBE和干净的海绵，镊子，手套进行转膜
7. 100V，380mA 4°C转膜30-60min
8. 转膜结束后，将膜（带有溴酚蓝的一面）放在干纸巾上1min，使膜表面的缓冲液吸进膜内, 不能使膜变干。紫外交联10分钟左右（可用凝胶成像仪的紫外）。
9. 用15ml 加热至42°C的封闭液Blocking Buffer封闭膜，轻柔摇床孵育15min
10. 将50μl Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加至16ml Blocking Buffer中，配制Conjugate/ Blocking Buffer。
11. 倒掉封闭液，加入上步的Conjugate/ Blocking Buffer，轻柔摇床孵育15min
12. 将40ml 4×Wash Buffer加至120ml纯水中，配制1×Wash Buffer
13. 将膜移入新平皿内，用20ml 1×Wash Buffer短暂漂洗1min
14. 用20ml 1×Wash Buffer轻柔摇床洗膜3次，每次5min
15. 将膜移入新平皿内，加入30ml 平衡液Substrate Equilibration Buffer，漂洗5min
16. 避光将6ml Luminol/Enhancer Solution加至 6ml Stable Peroxide Solution中，配制成Substrate Working Buffer
17. 将膜取出，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer，移入新平皿内
18. 用Substrate Working Buffer覆盖膜的全部表面，不要摇动，孵育5min
19. 将膜从Substrate Working Buffer提起，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer，但不要使膜变干。
20. 用保鲜膜包住尼龙膜，避免气泡和起皱。
21. 显影并拍照
个人建议用于EMSA实验的电泳槽及转膜用的东西与western blot的东西分开，避免影响实验结果。
网友评论