22年1月份的Gut，IF: 31.793
通讯作者：
这篇文章给我的感觉跟内毒素血症中肝细胞转录改变引起巨噬细胞招募和T细胞抑制有点像，都是做的细胞间的互相调控。
1. Reverse correlation between survival and fibrosis- inflammation in human patients with PDAC
Fig 1A： 多种染色结果提示PDAC肿瘤中存在大量CAF。而且这些PDAC-CAFs是PDGFRα和PDGFRβ阳性的。而且和周围正常组织相比，PDGFRα和PDGFRβ升高了十倍以上。为了区分inflammatory CAFs (iCAFs)和myofibroblastic CAFs (myoCAFs)，作者还对IL-6 和 α-SMA 进行了染色。结果提示PDAC组织中主要是myoCAFs，而IL-6+ iCAFs很少。
Fig 1B： 对20例PDAC和20例对照组织的qpcr结果也显示PDAC组织中PDGFRB水平增高。
Fig 1C-E： TCGA数据库中和正常胰腺相比，人PDAC组织的PDGFRB, FAP 和 PDPN都显著升高。
Fig 1F-H： 除了纤维化，PDAC组织中还存在着大量的CD163+巨噬。
Taken together, these findings show that human PDAC tumours contain high fibrotic and inflammatory components, which correlate with poor survival.
2. Specific upregulation of IL-33 in human PDAC and its correlation with inflammation
Fig 2A： 为了确定诱导PDAC炎症的潜在分子或细胞因子，作者进行了一个inflammatory profiling qPCR array。结果显示IL33出现了最显著的上调。
Fig 2B-D： qpcr、elisa和TCGA的结果都提示PDAC组织中IL33的上调。
Fig 2E： 免疫荧光结果提示IL33主要来自IL-6+ iCAFs。
Fig 2F： IL33的受体ST2主要在炎性单核/巨噬细胞表达同时也有一小部分在成纤维细胞中表达。
Fig 2G： 在小鼠肿瘤模型中，St2主要表达于freshly isolated F4/80+ TAMs。
Fig 2H： 同样的，在20例PDAC组织中CD163+ TAMs主要是ST2+的。
Fig 2I-J： 不管是TCGA还是作者自己的数据都显示IL33和CD163存在显著相关性。
Fig 2K-L： 对人和小鼠多种肿瘤组织的检测提示IL33在PDAC中特异性表达。
Together, PDAC stromal fibroblasts produce high levels of IL-33, which correlates with TAMs infiltration.
3. IL-33-induced TAM-CXCL3 production reversely correlates with patient survival
Fig 3A： 作者使用IL33干预了小鼠巨噬细胞，进行了RNAseq分析。结果提示存在Cxcl3的显著上调。
Fig 3B： 在人的组织 qPCR array中，CXCL3也是最显著上调的基因之一。
Fig 3C-D： qpcr和western验证了IL33刺激后CXCL3的上调。
Fig 3E： 为了研究TAM中L-33–ST2-依赖的CXCL3上调，作者构建了St2-/- (ST2 KO)鼠。并在St2-/- 鼠上种植了Panc02胰腺癌细胞。种植2w后，作者切除了肿瘤，分离了其中的F4/80+ TAMs，进行了Affymetrix microarray analysis。
Fig 3F： 结果显示敲除ST2后，TAM的CXCL3表达下降。
Fig 3G： si掉巨噬细胞的St2再加Il33干预，Cxcl3水平显著下降，也提示了Cxcl3的表达是Il33依赖的。
Fig 3H, I： TCGA和作者自测数据都提示CXCL3和IL33的表达具有很强正相关。
Fig 3J： TCGA数据中PDAC的CXCL3表达也显著高于正常胰腺。
Fig 3K, L： 作者对20例PDAC和20例对照的qpcr和western也提示PDAC组织的CXCL3显著更高。
Fig 3M： CXCL3水平与PDAC患者更差的DFS相关。
Fig 3N： 免疫荧光的结果提示CXCL3的表达与CD163+TAM共定位。
These findings show that activation of the IL-33–ST2 in PDAC–M2-TAMs leads to the high production of CXCL3.
4. MYC-dependent mechanism of CXCL3 upregulation by IL-33
随后作者探究了IL33诱导CXCL3上调的机制。因此作者对IL-33刺激后的巨噬细胞的通路进行了分析。
Fig 4A： 作者发现IL33诱导后存在mitogen-activated protein kinases extracellular signal-regulated kinase (ERK)和p38的活化。
Fig 4B： 为了探究这些分子活化和CXCL3表达的关系，作者使用了ERK inhibitor U0126 和 p38 inhibitor SB203580，发现它们可以阻断IL33诱导巨噬细胞表达CXCL3。
Fig 4C： 和分离自PDAC的F4/80-细胞相比，TAMF4/80+细胞显著高表达Cxcl3， 而且这个表达可以被TAMU0126和SB203580抑制。
These results showed that the F4/80+ monocytes / macrophages were primarily responsible for Cxcl3 production via ERK-mediated and p38-mediated regulatory mechanisms.
为了探究转录调控，作者employed a transcriptome approach to define transcription factors. （翻译组呢？没有看到数据啊）
Fig 4D： 鉴定出Myc是最显著上调的转录因子之一。
Fig 4E： qpcr证实了IL33诱导的Myc的上调，而且这个上调是RK-dependent 和 p38- dependent。
Fig 4F： 在F4/80+巨噬上也得到了一样的结果。
Fig 4G-H： Myc的siRNA和抑制剂10058-F4都阻断了IL33诱导的Cxcl3的上调。
These findings show a MYC-dependent mechanism of IL-33-induced Cxcl3 production.
Fig 4I： 对Cxcl3 promoter区的分析提示在−225 to −220 bp存在Myc的binding motif。
Fig 4J： Chip验证了MYC和Cxcl3 promoter区的直接结合。
Fig 4K： These findings uncover a novel IL-33–ST2–ERK/ p38–MYC-CXCL3 mechanism of CXCL3 production in macrophages
到这里，PDAC中TAM高表达CXCL3的机制就做完了。
由于CXCL3是一个分泌型趋化因子，作者接下来探究了CXCL3的受体CXCR2的表达，也就是开始做细胞互作。
5. Specific expression of CXCL3 in PDAC and its receptor CXCR2 in fibrotic cells
Fig 5A： 基于前面打的研究，作者假设IL-33–ST2–ERK/p38–MYC是CXCL3产生的关键pathway，而CXCL3应该是胰腺癌特异性表达的。因此作者在TCGA数据库中分析了多种肿瘤CXCL3的表达，发现PDAC是表达CXCL3最高的肿瘤之一。
Fig 5B： 对小鼠肿瘤的分析也得到了一致的结果。
随后作者探究了CXCL3的受体-CXCR2的表达。
Fig 5C-D： 发现在多种细胞系中，CXCR2在成纤维细胞中表达最高。更重要的是，PDAC肿瘤细胞(Panc02)中的CXCR2表达也很低。这些结果提示TAM表达的CXCL3可能通过CXCR2调节成纤维细胞，而不是肿瘤实质细胞。
Fig 5E： 使用Panc02和额外两种PDAC细胞系(K158和K399)染色结果同样提示肿瘤组织明显高表达CXCL3和CXCR2，且CXCL3主要是TAM表达，而CXCR2主要是α-SMA+ myoCAFs表达，而不是IL-6+ iCAFs。
Collectively, these three independent PDAC tumours show a general pattern of the stroma-derived CXCL3 and CXCR2 in altering TME in PDAC.
Fig 5F： 为了探究CXCR2表达和IL33信号通路的关系，作者对PDAC进行了药物阻断和敲除ST2的处理。使用sST2干预和敲除都降低了PDAC肿瘤组织中CXCR2和PDGFRβ的表达。
Fig 5G-H： 同样自测数据和TCGA都显示PDAC中CXCR2显著升高。
Fig 5I-L： 在人PDAC肿瘤组织中，CXCR2的表达和PDGFRB, FAP, PDPN显著相关。
Fig 5M： 小鼠PDAC肿瘤组织中，PDGFRβ 和 CXCR2 也存在显著共定位。而且和周围正常组织相比，PDAC中CXCR2的表达升高了接近20倍。
These data support the fact that CXCR2 is mainly expressed in PDAC-CAFs.
6. Activation of the CXCL3–CXCR2 confers the fibroblast-to- myofibroblast transition
找到CAF表达CXCR2之后，就是看CXCR2活化之后对CAF的影响了
Fig 6A-B： 随后作者分离了原代小鼠成纤维，使用CXCL3做体外干预后送了RNA-seq。结果显示Acta2被显著激活。同时Il6表达下降，提示CAF炎性下降，但向肌成纤维分化增加。
Fig 6C-E： qpcr验证了CXCL3刺激后肌成纤维marker (Acta2以及desmin, vimentin)的表达上调。提示myofibrotic transition是CXCR2依赖的。
Fig 6F： 鬼笔环肽染色提示CXCL3刺激的成纤维呈spindle-like形态，并存在overt actin fibres。此外，membrane ruffling结构的存在提示细胞存在high motility。而si掉Cxcr2后这种形态改变则消失，提示这些形态转变是Cxcr2依赖的。
Fig 6G： CXCL3刺激对增殖没有影响。
Fig 6H, I： 相反的，CXCL3显著刺激了成纤维的motility，而这个过程也是CXCR2依赖的。
These results indicate that activation of CXCR2 by CXCL3 leads to the fibroblast-to- myofibroblast transition (FMT), which significantly contributes to fibroblast migration.
7. Causative link between ST2 and CXCR2 signalling in FMT
Fig 6J-K： 对CXCL3干预的成纤维RNAseq数据中的migration and metastasis-related genes进行分析提示α-SMA (Acta2)是最显著高表达的基因，出现非常显著的高表达。
Fig 6L： small GTP-binding protein Rac在CXCL3-stimulated成纤维中也显著高表达。
Fig 6M： 在小鼠PDAC组织中，aSMA也出现了显著高表达（和肺癌相比，为什么不是和癌旁组织相比）。
Fig 6N： 给sST2或敲掉ST2同样阻断了PDAC中aSMA的表达。
Fig 6O-R： ACTA2在PDAC中高表达，与CXCL3表达呈正相关，且与患者预后相关。
8. CXCL3-primed myofibroblasts promote cancer metastasis
做了成纤维向肌成纤维转化之后，下一步就是看这个成纤维表型对肿瘤的影响（成纤维细胞和肿瘤细胞的共培养）
Fig 7A-B： CXCL3-primed 肌成纤维对Panc02胰腺癌细胞的增殖没有影响，但显著促进了细胞的motility。（条件培养基）
Fig 7C-D： 接下来作者直接做了共培养。同样的，肌成纤维和PDAC形成了cluster，而且CXCL3进一步增强了细胞cluster的形成。
Fig 7E-F： Gene expression profiling analysis提示collagen III 是CXCL3刺激的成纤维细胞上调最显著的粘附相关基因。
Fig 7G： si掉Col3a1则消除了cluster形成，说明这个现象是Col3a1依赖的。
Fig 7H： 此外，wound assay也提示silencing Clo3a1可以完全阻断CXCL3-MS5刺激的Panc02 motility。
These data suggest a CXCL3–CXCR2–type III collagen axis in governing the physical interaction between myofibroblasts and pancreatic cancer cells.
9. ST2–TAM–CXCR2-dependent PDAC metastasis
基本结论都有了，最后一part该往临床上靠了
Fig 8A： 为了探究这个发现的clinical relevance，作者develop了一个PDAC metastasis model。作者对Panc02荷瘤小鼠使用氯膦酸盐脂质体清除了巨噬细胞。与预期一致，在清除掉TAM之后，CXCL3和aSMA在肿瘤组织中的表达显著下降。
Fig 8B： 氯膦酸盐脂质体处理显著减少了metastatic nodules的数量。
Fig 8C-D： 同样的，使用药物或敲除st2来抑制IL33也得到了一致的结果。
Fig 8E-G： 在患者中，PDAC通常通过门静脉进行肝转移。为了复现这个临床表现，作者通过门静脉自发转移建立了clinically relevant metastatic model。在这个模型中，使用CXCR2特异性的inhibitor SB225002显著降低了aSMA的表达、TAM的招募荷CXCL3的表达。
Fig 8H-I： SB225002也显著降低肝转移。
Fig 8J-M： 为了进一步验证上面的结论，作者使用了另外2个PDAC肿瘤模型来进行自发转移实验。对518 和 K399 荷瘤小鼠给予S225002治疗显著降低了肺转移。
Taken together, these data demonstrate that the ST2–TAMs–CXCL3–CXCR2 axis is a crucial signalling pathway in promoting PDAC metastasis.
10. Disruption of integrin β-1 inhibits PDAC metastasis
Fig 8N： 已知整合素α1β1 和 α2β1 介导了和col3的互作，因此作者在Pac02 PDAC转移中阻断β1整合素 (使用shRNA) 的作用。结果显示knock down of β1 integrin 显著降低了PDAC的转移。
These findings show that the β1 integrin is crucial for mediating the collagen III-integrin interaction and metastasis.
Cancer cells and other stromal cells such as vascular endothelial cells produce platelet-derived growth factors (PDGFs) and transforming growth factor β (TGFβ) that activate stromal fibroblasts and perivascular cells in tumour microenvironment. Activated CAFs and perivascular cells produce high levels of IL-33 that primarily targets the ST2+ inflammatory macrophages. IL-33-stimulated tumour-associated macrophages (TAMs) express high levels of CXCL3 through a MYC-dependent mechanism. CXCL3 induces fibroblast-to-myofibroblast transition (FMT) through its specific receptor expressed on cancer-associated fibroblasts (CAFs). CXCL3-induced myoCAFs express high level of collagen III on their surface and hijack pancreatic cancer cells through integrin binding. MyoCAFs acts as a driver to carry PDAC cancer cell metastasis as a metastatic myo-CAF-PDAC cluster. MyoCAFs might help cancer cells for intravasation, extravasation, the formation of the initial metastatic niche, and regrowth in distal organs such as liver.
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