Transwell技术自诞生以来，在研究细胞共培养、趋化性、迁移、侵袭实验中都发挥了重要的作用，但是随着科技的进步和发展，科研工作者们对Transwell实验提出了更高要求，对小室中的微量细胞因子和细胞间信号联系的研究也越来越多。为了解决精准调控和监管培养液中不同因子的含量以及变化的需求，全新升级的Microfluidics-Transwell系统应运而生，它是建立在传统Transwell系统上的细胞培养升级系统：Transwell系统搭配微流控技术，可以模拟体内在流体环境下的细胞生长情况，最大程度再现某种体内流体环境，以保证细胞生长和细胞间联系的“本真”状态，达到不同的实验目的。
本期推送为大家带来一篇采用Microfluidics-Transwell培养3D人肠道上皮细胞的研究论文，一起来看看吧。
文章信息 .
文章题目：3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chipwith a cell culture insert.
期刊：Natrue Protocols
影响因子：13.491
发表日期：2022年2月2日
DOI：10.1038/s41596-021-00674-3
【研究概述】
文章介绍了两款仿生肠道芯片：Gut-on-a-chip肠道芯片和Transwell-insertable chip混合芯片，可以诱导自发的肠道上皮3D形态发生，具有良好的生理功能和生物力学特征。这种仿生肠道芯片结合了微流控技术，可以诱导Caco-2或肠道类器官上皮细胞发生，通过控制基底外侧液体流动实现功能性肠道微结构的再生。其中，Transwell-insertable chip混合芯片构造更简单，使用方便，可插入的Transwell可以独立培养肠道上皮细胞，该芯片搭配微流控系统可以为体外形态发生提供生理学相关的剪切应力和机械运动，不需要复杂的细胞工程或操作，体现出比其他现有技术更多的优势。Transwell-insertable chip混合芯片提供了一种体外3D肠上皮细胞再生方法，对生物医学研究界将产生广泛影响，可应用于生物医学、临床医学和药物毒性和药理学等研究领域。
Transwell-insertable chip混合芯片结构：
图1. Transwell-insertable chip混合芯片结构示意图
Transwell-insertable chip混合芯片的结构如图1所示，由Transwell插件、微通道层和玻璃片组成，其中微通道分别由流入口和流出口与微流控系统连接。将独立制备的用于培养单层肠上皮细胞的Transwell插件插入混合芯片中，培养基通过建立在Transwell插入物上的细胞层下面的微通道灌注，以诱导肠三维形态发生。
研究中混合芯片的实验方案步骤可简单总结为以下五步：
🔹 Transwell-insertable chip混合芯片的制备；
🔹 肠上皮细胞(Caco-2细胞或人肠类器官)的制备；
🔹 混合芯片上培养肠道上皮细胞；
🔹 体外三维形态发生的诱导；
🔹 三维上皮微结构的表征。
Transwell-insertable chip混合芯片肠上皮细胞3D培养特征：
图2. Transwell-insertable chip混合芯片中肠上皮细胞形态发生特征图
如图2 Transwell-insertable chip混合芯片中肠上皮细胞形态发生特征所示，混合芯片中诱导肠道形态发生的流程：
1）将分离的上皮细胞放入准备好的Transwell插件中；
2）细胞被播种并附着在Transwell插件的聚酯膜上，所有细胞都在静态条件下培养(TW培养)；
3）7天后，将含有单层上皮细胞的单个Transwell插入物整合到混合芯片中并接入基底外侧流动(flow, BL)；
4）最终生成三维上皮细胞层(Morphogenesis)。
图b所示混合芯片(左图)诱导肠上皮细胞的类器官三维形态发生，在不同的z轴位置(上、中、下；见右侧示意图对应的虚线)显示出明显的形态特征。其中青色为肌动蛋白，灰色为细胞核。图c为肠上皮细胞在静态Transwell中培养(TW;左上角小图)和在混合芯片中诱导培养后（Hybrid Chip；下方大图）的荧光共聚焦显微图，可以清晰观察到混合芯片中产生了三维形态；XZ视角横切视图(右上角小图)也显示混合芯片培养的肠上皮细胞发生了三维形态的改变，而静态Transwell中培养得肠上皮细胞未见形态变化。
Transwell-insertable chip混合芯片优势分析：
1. 研究中提及外源性添加Wnt拮抗剂到芯片上会抑制三维形态发生或破坏预结构的三维上皮层，提示了在三维培养过程中的拮抗力与体外肠道形态发生有关。因此，利用微流控系统通过主动清洗或扩散基底外侧培养液中的形态拮抗剂，可以促进肠上皮细胞三维形态形成。
2. 混合芯片优于体内动物模型以及其他传统的静态二维细胞培养模型。动物研究对劳动力和成本要求高且存在动物伦理问题。最重要的是，遗传背景差异使得动物模型不能准确地替代模拟人的组织器官的发生和生理代谢等过程。混合芯片的细胞可以是病人组织样本来源，尽可能消除物种间差异。此外，混合芯片是微流控3D培养，相比传统静态二维培养更加真实地模拟体内动态变化的生理环境对细胞的影响
3. 混合芯片中提供了自发的肠道形态发生和生理相关的剪切应力，可以模拟肠道蠕动的生物力学，以及独立并可反复操作的Transwell可插入式顶室和基底外侧室。相比较与肠道干细胞培养得到的封闭肠道类器官，混合芯片可以方便快捷地引入微生物细胞或外源抗原，进行转运分析或宿主-微生物组共培养；相比于传统的水凝胶支架类器官，混合芯片可在微流控系统的控制下为整个微环境提供动态的腔内或间质流动，和生理功能所需的流体剪切应力，准确反映活跃的体内生物力学。同时，传统的类器官预构造的三维水凝胶支架可能会阻碍肠上皮细胞的自发形态发生过程。
Transwell-insertable chip混合芯片应用前景分析：
1. 为基础医学、药学等基础研究领域提供新的工具和手段。混合芯片具有可重复性和系统稳定性，可以研究肠道发育、再生或稳态过程中细胞信号动力学；可以研究诺如病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)、艰难梭状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或霍乱弧菌等各种感染性病原体下的疾病病理和发病机制；允许纵向共培养，以及随后评估宿主防御、免疫反应和胃肠道(GI)中病原体相关的损伤修复；使用患者的活检或干细胞来源的肠类器官制备三维肠上皮层时，可以模拟肾炎或肠易激综合征；可以考虑在包含三维肠绒毛-隐窝微结构中添加与疾病相关的其他细胞类型，以更好地模拟疾病环境的复杂性。
2. 混合芯片具有可组装的Transwell室，易于拆卸和操作。可以在没有切片过程的情况下固定和可视化，进行转录组学研究和高分辨率或超分辨率成像，以绘制三维上皮微环境中基因和蛋白质对微生物或免疫刺激的时空动态响应；同时经过设计改造后可配合24、96或384孔板，加上微流控系统可以连续补充基底外侧区室，适合在制药、生物医学或食品工业中开发高通量筛选或验证平台。
【总结】
全新升级的Microfluidics-Transwell系统在以下几个方面尽显优势：
☑ 可以精确控制下室培养液的种类、因子含量以及给液速度，尽可能模拟体内细胞外基质和流体环境，满足多种实验需求；
☑ 可以精确定量下室培养液成分变化，检测上下层培养细胞分泌的细胞信号物质，更准确地研究细胞间联系；
☑ 可以再现流体环境并且更加真实地模拟肿瘤细胞转移过程（肿瘤细胞内渗、进入循环系统、肿瘤细胞外渗、形成转移灶等）。
网友评论