胆囊癌 (GBC) 是最常见的胆道癌症，也是全球第六大最常见的胃肠道癌症，其中胆囊腺癌占 GBC 的 85% 以上，具有异质性高、预后差的特点。因此，为了解析该恶性肿瘤的细胞异质性和细胞间的相互作用，来开发新的方法以提高治疗水平，研究者使用单细胞转录组测序技术，揭示了驱动恶性转化的肿瘤细胞和免疫细胞的特性，并鉴定了可能作为癌症治疗新靶点的细胞与分子。
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文章题目：Single-cell RNA-sequencing atlas reveals an MDK-dependent immunosuppressive environment in ErbB pathway-mutated gallbladder cancer.
中文题目：单细胞转录组测序在ErbB通路-突变的胆囊癌中揭示一个MDK依赖的免疫抑制环境
发表时间：2021.11
期刊名称：Journal of hepatology
影响因子：25.083
实验平台：10x Genomics Chromium scRNA-seq
DOI：10.1016/j.jhep.2021.06.023
研究内容
· GBC患者肿瘤异质性
研究者首先对13例未进行治疗的配对肿瘤和癌旁样品进行单细胞转录组测序，一共获得114927个细胞。其中57607个细胞来自于原发性肿瘤而57320个细胞来自于癌旁，聚类分析获得16个不同的细胞类型。细胞类型包括上皮细胞、内皮细胞_VWF、内皮细胞_DCN、肌成纤维细胞、CAFs_MFAP5、CAFs_ACTA2、肥大细胞、滤泡B细胞、浆B细胞、Treg、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、类单核细胞、M1和M2巨噬细胞以及DC。结合每个组织的单细胞转录组和bulk 转录组测序结果的相关性，说明单细胞转录组测序结果可代表GBC患者的个体细胞特征。在13个患者不同细胞类型中，研究者发现每种细胞类型的比例有很大差异。M2巨噬细胞、Treg和上皮细胞在所有肿瘤中比例都高于良性对照，而CAFs_MFAP5、内皮细胞_DCN和类单核细胞在对照中的比例比肿瘤高。这些结果表明GBC癌症具有肿瘤内和肿瘤间的异质性，患者具有复杂的细胞生态。
Fig.1 来自13对癌症和邻近正常组织的肿瘤内细胞异质性
· 上皮细胞亚型分析
大多数研究表明恶性胆囊癌细胞来源于上皮细胞。因此，研究者将重点放在了上皮细胞中。根据marker基因对上皮细胞进行亚型分析获得了四个亚型。其中亚型1，2，3主要分布于8个腺癌（AC）患者中，而亚型4分布于一个鳞状癌（ASC）患者中。根据研究者的分析结果，每个患者的上皮细胞各自形成了特定的类群：每个肿瘤内用2000个高可变基因计算任意2个上皮细胞的转录组距离都显著小于这个肿瘤与其他肿瘤上皮细胞的转录组距离。此外，亚型1参与多样的生物学功能包括对脂多糖的反应、整合素介导的细胞黏附；亚型2与细胞分裂和有丝分裂细胞周期的调控密切相关；亚型3介导免疫相关的过程包括干扰素-γ介导的信号通路、抗原加工和通过MHC-I类的多肽抗原呈递；亚型4参与细胞黏附和细胞发育。为了确认不同的上皮细胞亚型是否具有不同的遗传变异，研究者进行了染色体拷贝数变异（CNV）分析，并发现9个样品中有4个癌组织上皮细胞CNV水平高于正常组织，尤其是亚型2和3显著高于亚型1。
考虑到胆囊腺癌占胆囊癌患者群体的85%以上，研究者首先研究腺癌患者的上皮细胞亚型。亚型2和3定位于肿瘤组织，而亚型1主要在临近正常组织里。因为亚型1和2均与细胞增殖有关，并且在AC肿瘤中占上皮细胞的较大比例（93.4%），因此对其进行轨迹分析。结果表明，亚型1细胞主要聚集在邻近的正常组织中，在肿瘤组织中逐渐减少，而亚型2上皮细胞在肿瘤组织中增加。与亚型1相比，许多促肿瘤基因在临界点状态细胞中上调，比如MYC和CXCL5。同样，与临界点细胞相比，亚型2中有大量基因上调表达，比如ENO1和CDK1。功能富集分析表明，亚型1、临界点细胞和亚型2中不同功能基因具有不同的功能图谱，这显示了可能介导肿瘤发生和进化的不同上皮类型的功能特征。
针对ASC特异性基因的表达水平分析显示，KRTDAP、FAT2和TP63均显著上调，与患者的bulk RNA测序结果一致。ASC中亚型4的特异性上皮细胞标志物与TCGA数据库中其他人类癌症（如肺癌和宫颈癌）的鳞状细胞癌相同。这些结果表明KRTDAP和FAT2可作为胆囊ASC的生物标志物。
Fig.2 上皮细胞亚型的异质性
· GBC患者的外显子测序分析
研究者对9例GBC患者进行外显子测序，分析体细胞突变，包括SNV和InDel。对于SNV，C>T/G>A突变在所有肿瘤中占优势。GBC1、2、5、7和8中SYNE1、TP53、POU5F1、HSP90AB1和FGFR3的高突变频率与先前的肿瘤驱动基因数据库中的记录相似。此外，与其他病例相比，这5例GBC样本中的体细胞CNV数量和染色体分布具有相似的模式。这与转录组学的相似性是一致的。具体来说，这5名患者中任何2个上皮细胞之间的距离都显著低于这些患者与任何其他患者之间的距离。鉴于之前在GBC患者中发现ErbB通路的高频率突变，研究者将重心放在了本次结果中该通路的突变情况。9样品中有3个检测到了该通路的体细胞突变，包括GBC1、2和7。GBC7中发现了ErbB3的突变。结合转录组结果发现，这三个样品的距离更相近。与相邻正常组织相比，3例中的2例含有大量Treg、上皮细胞和M2巨噬细胞群，暗示ErbB通路突变可能参与这些细胞亚群的激活和增殖。
Fig.3 9个GBC组织的基因组突变
· 具有ErbB通路突变的GBC患者上皮癌细胞中MDK表达上调
为了探索ErbB通路突变与癌细胞免疫逃逸之间的潜在关系，研究者根据是否有ErbB通路突变对8名AC患者进行分类。与Tn（无突变，GBC3、4、5、6、8）相比，Tm（有突变，GBC1、2、7）中上皮细胞亚型1和2、Treg和M2巨噬细胞群的细胞差异更大，结合IHC结果可知ErbB通路突变患者样品里有相当多的Treg和M2巨噬细胞亚细胞群。对这些细胞进行配体受体互作分析发现，Tm中上皮细胞（亚型1和2）与包括Treg细胞在内的其他细胞类型的交流比Tn更活跃。使用基尼指数程序分析潜在的候选分泌蛋白，发现在有ErbB通路突变的上皮细胞中，CD24、中期因子（MDK）和SERPINA1相对于没有ErbB通路突变的细胞来说基尼指数是升高的，基因表达水平也同样如此。配体受体互作分析发现MDK-LRP1和MDK-SORL1在突变的癌症中起主要作用。在ErbB突变的癌症中，上皮细胞、单核细胞样细胞、M1和M2巨噬细胞显示出比没有ErbB突变的癌症更强的MDK-LRP1/SORL1相互作用。在GBC2和7中积累了相当数量的MDK相关受体突变。MDK上调NUPR1和CXCL10，免疫荧光分析表明在具有代表性的浸润CD68+巨噬细胞的GBC1组织中，MDK在上皮细胞中的表达水平明显高于GBC8样本。总之，在具有ErbB通路突变的GBC患者中，上皮细胞通过MDK可能与巨噬细胞进行强烈的细胞互作反应。通过细胞转染实验验证可知，ErbB通路突变以依赖于PI3K/AKT的方式促进MDK表达。
Fig.4 具有或不具有ErbB通路突变的肿瘤间上皮细胞亚型的差异和预测的细胞-细胞相互作用
· MDK-LRP1 促进免疫抑制性巨噬细胞分化
早期证据暗示肿瘤微环境（TME）中MDK介导的上皮性肿瘤细胞与相邻免疫细胞之间可能存在一种亚细胞相互作用模式，因此，研究者提出一种假说：ErbB通路突变的上皮来源肿瘤细胞诱导MDK表达，MDK的表达可以抑制亚细胞群体的抗肿瘤免疫。为了验证这一假说，研究者对构成肿瘤中浸润性免疫细胞主要群体的巨噬细胞亚群进行研究。与Tn相比，STAT1及其靶基因(CXCL9和CXCL10)在TM的免疫抑制性巨噬细胞中表达上调。此外，配体-受体配对分析显示，TM的CD4+T和Tregs中的CXCL10-CXCR3相互作用比TN中的强，这表明携带ErbB通路突变的GBC肿瘤的M2巨噬细胞可能通过招募或激活CD4+T细胞和Tregs而使上皮细胞免疫逃逸。为了验证MDK是否起到重要作用，研究者用重组蛋白MDK和收集到的人GBC细胞条件培养基处理人单核细胞系（THP-1），发现对单核细胞分化产生显著影响，并且黏附细胞增加，M2巨噬细胞标志物受诱导表达，但是M1标志物减少。此外，MDK受体LRP1在Tm的M1和M2巨噬细胞中同时过度表达，然而将PBMC暴露于LRP1中和抗体可显著降低M2群体，siRNALRP1完全阻断MDK诱导的THP-1细胞粘附和扩散，从而损害细胞分化。这一证据表明，MDK-LRP1是免疫抑制性巨噬细胞分化的关键因素。Transwell迁移实验表明，MDK诱导的M2巨噬细胞能增强对 CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的招募。
Fig.5 MDK 通过与 LRP1 相互作用促进免疫抑制性 (M2) 巨噬细胞分化
最后，研究者对41例另外收集的样本（Tm=21;Tn=20）进行了免疫组化分析，在ErbB通路突变的患者中，MDK的表达显著升高。根据MDK表达高低将这些GBC患者进一步分为两组，以比较生存率。结果表明，MDK高表达与总生存期较短显著相关。此外，免疫荧光染色显示，Tm表达更高水平的MDK、CD163和FOXP3，这表明肿瘤细胞源性MDK激活免疫抑制性巨噬细胞的浸润，从而在具有ErbB通路突变的组织中招募Treg到TME。所有结果表明，ErbB通路突变上调的MDK是促进免疫抑制性巨噬细胞分化的关键因素，进而激活Tregs，导致肿瘤免疫逃逸和肿瘤发展。
Fig.6 MDK 在具有 ErbB 通路突变的GBC中上调
主要结论
本研究利用单细胞转录组测序技术从13个GBC癌与癌旁组织中获得了114927个细胞，鉴定出16种细胞类型，其中上皮细胞、M2巨噬细胞和调节性T细胞在ErbB通路突变的肿瘤中占优势。此外，上皮细胞亚型1、2和3主要见于腺癌，4亚型见于腺鳞癌。具有ErbB通路突变的肿瘤含有更多的上皮细胞亚型1和2，并且比没有ErbB通路突变的肿瘤表达更高水平的分泌型中间因子（MDK）。 MDK增加导致其受体LRP1相互作用，LRP1由肿瘤浸润性巨噬细胞表达，并促进免疫抑制性巨噬细胞分化。此外，巨噬细胞分泌的CXCL10与其调节性T细胞上的受体CXCR3之间的交互在具有ErbB通路突变的GBC中被诱导，并且MDK升高与GBC患者总体生存率低相关。这项研究为 TME 中的转录组异质性和整体细胞互作网络提供了有价值的见解，它们协同作用以促进具有 ErbB 通路突变的 GBC 的进展，从而揭示了癌症治疗新的细胞和分子靶点。
参考文献
Zhang, Yijian et al. “Single-cell RNA-sequencingatlas reveals an MDK-dependent immunosuppressive environment in ErbBpathway-mutated gallbladder cancer.” Journal of hepatology vol. 75,5 (2021):1128-1141.
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