革兰氏染色的基本原理及方法

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革兰氏染色的基本原理及方法

  今天哪也不想去，就宅在家里整理一下资料吧！先来学习一下革兰氏染色吧！

  革兰氏染色法是1884年由丹麦医师Gram创立。至今仍是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。

  细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色.在一定条件下，有的细菌媒染后的颜色不被脱去，有的可被脱去，因此把细菌分为两大类。前者叫做革兰氏阳性菌(G+)后者为革兰氏阴性菌(G-).为方便进一步观察，脱色后可再用碱性染料蕃红进行复染，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。

  革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫于碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄，且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄或蕃红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色的基本原理及方法

了解了原理以后，咱们就来看看染色步骤吧！一般包括四个步骤:初染、媒染、脱色、复染。接着就来了解一下具体染色方法以及一些注意事项。

革兰氏染色的基本原理及方法

(一)涂片，干燥

  1.在干净的载玻片中央滴加一滴蒸馏水，如用移液枪，大约就10ul就可以。

  2.然后用接种环(灭菌后冷却)或用一次性环，无菌操作，挑取少许培养物(粘一下，不要用力)，如果是纯菌单菌落时，碰一下就很多了，别用力粘到都看得见，那就很多了(切记)，然后置载玻片的水滴中，与水混合做成菌悬液并涂成一个薄片，如涂抹后不易观察，可提前用记号笔在玻片反面画一个圈作一个标记。

  3.干燥:最好在室温条件下，使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可用手拿着迎风甩干或放在生物安全柜风口上。

  4.干燥后即过火固定，固定的目的有三个:(1)杀死微生物，固定细胞结构。

(2)保证菌体能更牢固的粘附在载玻片上，防止标本水洗时被水冲掉。

(3)改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色固定。

利用高温，手执载玻片一端，标本向上，快速通过酒精灯火焰外层3-4次，共约2-3s，玻片接触皮肤，在手背上轻轻拍，目的是看有多高温度，接触不太烫，又有温度，说明过火最合适。

  (二)然后，进行染色

  在固定过的涂片菌膜上滴加结晶紫染色液，多滴两滴，染色液覆盖住菌膜，计时1min.

  (三)水洗

  染色到一定时间，可以用洗瓶从玻片一边慢慢冲水，注意水流要慢，毕竟固定过火都是虚松的，太急容易把菌冲没，只需细小的水流把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则被保留。

  (四)媒染

  直接滴加碘液(不需要干燥)覆盖涂抹面，染1min，这时紫色的印记就变的有点黑(碘的结果)媒染剂与染料形成不溶性的化合物，增加染料和细菌的亲和力。注意媒染时间控制在50~60s为宜。时间过长，结晶紫在碘液长时间作用下过分牢固结合，在菌体细胞壁上，影响酒精脱色效果，从而会导致假阳性的效果。

  (五)水洗

用细小的水流(温柔的)冲洗掉涂片上的染色液，用吸水纸吸干。

  (六)酒精脱色。

  斜向下拿住玻片使之成30-45°角，然后滴加酒95%酒精，酒精可以倒入洗瓶内，一口气缓缓的捏着冲洗一遍，酒精顺着玻片蔓延到中间，经过菌液，玻片下边开始往下滴，刚开始滴下来的呈黑色，慢慢变淡，然后无色，无色的瞬间赶紧换水冲洗，还是从上面往下冲洗，赶紧把酒精冲掉，洗脱时间一点要掌握好，控制在20-30s之间，否则，酒精脱色时间短，脱色效果不佳，会导致阴性菌体内的结晶紫和复合物不能有效的全部洗脱出来，出现误差，使阴性菌出现假阳性。如果洗脱时间过长，也会导致阳性菌的细胞壁被酒精破坏导致细胞内的紫色被洗脱，呈现假阴性，因此洗脱时间也是革兰氏染色的关键环节。

  (七)复染

  蕃红染色液，染色10s后，自来水洗掉，滤纸贴一下，玻片不要滑动，滤干多余的水

  (八)镜检

  油镜观察，注意油不要太多，等玻片干了再加，湿的时候有水会产生气泡，不易观察。

革兰氏染色的基本原理及方法

  好了，墨迹半天了！就到这里吧！在这里要感谢一下一位烦人的老师!至于他是谁就不提了！总之跟他学到了很多知识!感谢的话就不多说了！

革兰氏染色的基本原理及方法