革兰氏染色

一. 原理
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫和碘的复合物，革兰氏阳性菌细胞由肽聚糖网状结构交联且致密，乙醇脱色时候，肽聚糖脱水使孔径缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈现紫色。革兰氏阴性菌外膜层类脂含量高，肽聚糖层较薄交联程度差，脱色后类脂外膜迅速溶解，缝隙加大，结晶紫与碘复合物溶出，因此乙醇脱色后再经过番红复染，呈红色。

二. 操作步骤
1. 涂片固定
菌液涂片时不可用于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2. 染色
   一般包括初染、媒染、脱色、复染等4个步骤，具体操作方法是：
   （1）加上结晶紫后，染色1min，水洗。
   （2）加上碘液后染色1min，水洗。
   （3）加上95%酒精，摇动拨片，根据涂片厚度，脱色约20-60s，水洗，吸取水分。
   （4）加上番红后，染色1min，水洗。
   （5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
   (四个1min，一个30s)
   革兰氏染色的关键在于严格掌控酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡的菌体自行溶解，都常呈阴性反应。
3. 结果观察
   革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色，以均匀散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。

三. 注意事项
1. 标本涂片不能太厚，严格按照操作要求进行，若涂片较厚，应延长脱色试剂，直至不再出现紫色为止。
2. 玻片通过火焰温度不能太高。
3. 碘液变透明，则不能使用。
4. 水洗时动作要轻柔，严载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
四. 感想与感悟
1. 一个载玻片做一个菌，过多，水洗和脱色时候容易混在一起。
2. 如果你做的是液体培养的菌液，可以吸取1-2μL涂片，如果你做的是平板菌落的染色，可能菌落涂不开，挑去单菌落放入50μL-100μL的稀释后，取1-2μL涂片。
3. 如果看不清菌丝状态，很多聚集在一起，是涂片过厚导致的。
4. 可以做一个阳性对照，如做一个已知的革兰氏阳性菌或者革兰氏阴性菌，确定染料是否好用。

最后，附两张我做的片子和革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞壁图片。

PTYG1-11.jpg
PTYG5-1.jpg
16-23-00-32-1.jpg