MLL3 loss drives metastasis by promoting a hybrid epithelial–mesenchymal transition state

MLL3缺失通过促进混合上皮间充质转化状态促进转移

背景

• EMT：上皮-间充质转化可以促进细胞的侵袭、循环（就是可以促进转移的发生）
• MET：间充质-上皮转化可以促进细胞的定植（到了定植的地方，需要MET来完成侵袭）
• hybridEMT：完成上面两步才可以完成转移
• histone methyltransferase MLL3：组蛋白甲基转移酶3，既往研究证明其可以加速肿瘤的生发和生长，但是对转移的作用不明确。
  • MLL3是COMPASS家族中的一员，具有赖氨酸甲基化转移酶的活性。
  • 以往的研究证实，MLL3复合物通过结合在基因的增强子（enhancer）上调控基因的表达
    • Hu D, Gao X, Morgan MA, Herz HM, Smith ER, Shilatifard A. The MLL3/MLL4 branches of the COMPASS family function as major histone H3K4 monomethylases at enhancers. Mol Cell Biol. 2013 Dec; 33(23):4745-54
  • 在小鼠中敲除MLL3则会增加多种癌症的风险和促进癌症的发展
    • Chen C, Liu Y, Rappaport AR, Kitzing T, Schultz N, Zhao Z, Shroff AS, Dickins RA, Vakoc CR, Bradner JE, Stock W, LeBeau MM, Shannon KM, Kogan S, Zuber J, Lowe SW. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 2014 May 12; 25(5):652-65.

开始做实验

MLL3 loss enhances breast tumour metastasis

MLL3缺失提升乳腺癌肿瘤的转移

首先先是分析了一下这玩意是怎么突变，主要是点突变和基因缺失。接着就上TCGA看，发现有突变的预后差，但是远处转移变少了！！！（各种转移都少了）且转移灶中MLL3的表达是减少的。说明这玩意导致恶性预后但是不让他转移？？（是不是从这个怀疑他会不会和混合EMT有关系）

图片.png

接着就是养老鼠，用Luc2-Tomato标注了3种肿瘤细胞细胞，并用CRISPR干掉MLL3。

名称	来源/形态	培养基	细胞表达
MDA-MB-231腺癌细胞	乳腺/乳房; 源自转移部位：胸腔积液；上皮细胞 L-15	培养基，90%；优质胎牛血清，10%。气相：空气，100%。温度：37℃。DMEM培养基，90%；优质胎牛血清，10%。气相：37 ℃, 5% CO2	ER(-); PR(-); HER2(-); TP53++M；贴壁生长；表达表皮生长因子EGF受体、转化生长因子TGF-α受体和WNT7B癌基因。
MDA-MB-435浸润性导管癌	乳腺/乳房	DMEM培养基，90%；优质胎牛血清，10%。气相：37 ℃, 5% CO2	ER(-); PR(-);TP53+M
SUM159PT间变性癌（三阴性乳腺癌）	乳腺	Ham’s F12，5%-IH气相：37 ℃, 5% CO2RPMI-1640)，90%；优质胎牛血清，10%。	ER(-); PR(-); HER2(-); TP53-;具有高度转移性。

• 在231中，原发肿瘤明显增大，肺、肝转移风险均明显增大（mutaiong burdern）
• 在435和和159中，虽然原发肿瘤没有明显增大，其发生的自发转移明显增加。

图片.png

Loss of MLL3 promotes metastatic colonization

MLL3缺失促进转移定植

背景：循环肿瘤细胞（CTC）反映了肿瘤细胞在侵袭入循环、在体内循环和存活的能力。

前面证明了MLL3缺失小鼠转移情况增加，那么接着就要看，到底是什么原因，是影响入侵还是影响转移，就用CTC评估一下。

这儿就看了一下MLL3确实和不缺失小鼠的CTC情况。结果发现MLL3缺失和不缺失不会影响小鼠体内肿瘤侵入循环系统。同时通过尾静脉注射，并且评估带荧光的肿瘤细胞渗透到血管外的频率（血管用FITC凝集素标记了）。结果就是MLL3不影响MLL3的外渗。（这个肺的血管）

图片.png

小结论：这儿就是说明了MLL3的改变既不影响进血也不影响离开渗透出血管，那么他影响转移估计就是影响定植了？？

既然测了在肺里的渗透，下面就要看影响定植的问题。尾静脉注射一周后，MLL3-WT和MLL3-Mutation的癌细胞数量和克隆大小相似。这说明MLL3缺失不影响渗出细胞的初始播种和存活，但是，MLL3缺失组的肺转移灶明显变大，转移负担更明显。

注：这个转移负担一直没搞懂，metastatic burden。

这个e图应该是流式。

SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（granularity）

图片.png

接着有做了已给免疫组化看了一下突变情况，MLL3确实后Ki67+的细胞明显更多了，同时裂解的Caspase-3 阳性细胞没有明显增加（附图偷懒）。之前说的都是231细胞系，那么159里呢？MLL3缺失也导致转移定植超级加倍。

Caspase-3是一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起到关键作用，被广泛用作凋亡的生物标志物。

图片.png

为了评估在具有免疫能力的宿主中的肺定植，我们生成了携带Trp53 CRISPR 缺失和Pik3ca H1047R突变的小鼠乳腺干细胞（mouse mammary stem cell，MaSC）类器官，然后用慢病毒CRISPR进一步敲除MLL3

理解：最后就是创建MLL3缺失或没缺失的Trp53 缺失 / Pik3ca H1047R的 MaSC。

PIK3CA H1047R：PIK3CA H1047R是一个热点突变，位于PIK3CA蛋白的激酶结构域(http://UniProt.org)。H1047R导致Akt和Mek1/2磷酸化增加，生长因子独立的细胞存活和细胞培养中的转化(PMID: 26627007, PMID: 29533785)。

在同基因FVB/n小鼠尾静脉注射后，两个MLL3缺失的MaSC独立系产生的转移负担明显高于MLL3-WT细胞。

FVB小鼠毛色为白色，起源于Swiss小鼠，1966年起开始选育，在接种百日咳疫苗后，其中一系HSFS/N对组胺敏感。到70年代初HSFS/N系第八代中，发现携带Fv1b等位基因的小鼠对B型Friend白血病敏感，后将这些小鼠育成Fv1b同型合子近交系，故称FVB。由于FVB小鼠受精卵中的原核突出显著且生产性能好、产仔量大，常用于转基因显微注射。FVB小鼠自发肿瘤率低，但化学诱导易发鳞状细胞癌。

图片.png

结论：总之，这些结果表明MLL3的缺失增加了转移定植。

MLL3 loss facilitates hybrid EMT in mesenchymal cells

MLL3缺失混合EMT中的间充质细胞

背景：MDA-MB-231原发肿瘤细胞具有vimentin (VIM)+ /E-cadherin (Ecad) - 间充质表型

• 所以就是231肿瘤本身发生了EMT的

Vimentin 角色4：EMT 间充质标记
上皮-间充质转化是一种生物学过程，可让极化上皮细胞转化为减少细胞附着、增加迁移和侵袭性的间充质细胞。上皮-间充质转化参与胚胎发育、修复、癌症进展和转移。Vimentin 是上皮-间质转化 (EMT) 的分子标志物之一，常搭配上皮标记 E-Cadherin 一同研究。除了 E-Cadherin 与 Vimentin 这二个关键明星，ZO-1、N-Cadherin、Snail、ZEB1 也是研究上皮-间质转化的固定班底。

3.1 E-Cad表达下调与波形蛋白（Vimentin）表达升高

在EMT发生过程中，E-Cad表达下调的同时，常伴随有多种间充质相关蛋白的升高，其中较为明显的是波形蛋白（Vimentin）的表达升高。波形蛋白表达升高会干扰E-Cad介导的细胞黏附，从而增加肿瘤细胞的迁移性。转移中的肿瘤细胞可以伸出伪足，内有许多肌动蛋白聚集成丝，这些肌丝的收缩推动了细胞的前进；同时，癌细胞分泌蛋白酶降解细胞外基质，使基底膜产生局部缺损，以允许癌细胞通过。Irie等的研究中提到了蛋白激酶B（AKT或PKB）在调节肿瘤细胞转移和侵袭时的功能特异性。AKT1的下游调节可增强表皮生长因子（EGF）应答刺激中的迁移，从而诱导出EMT的表型：即抑制E-Cad表达，而波形蛋白表达略有增加。相比之下，AKT2下游调节就不能加强细胞迁移或改变E-Cad的表达，但其可以减少波形蛋白的表达。

徐浩翔等在综述中提到了Singh在2003年发表的一个实验：比较高侵袭性前列腺癌细胞LNCap和低侵袭性癌细胞CL1的差异蛋白时发现，LNCaP中波形蛋白的含量是CL1细胞含量的20倍，向LNCaP细胞和CL1细胞分别导入表达反义波形蛋白和正义波形蛋白的载体以改变波形蛋白的含量，结果发现原本高侵袭性LNCaP细胞的迁移数量明显减少，低侵袭性CL1细胞的波形蛋白表达水平升高但其迁移程度未明显改变，所以他们认为癌细胞中波形蛋白的高表达与细胞的侵袭性相关，波形蛋白可能通过作用于其他蛋白或者影响细胞侵袭过程较晚的阶段才能最终改变细胞的迁移能力。

所以作者就接着想看看转移灶中的癌细胞是不是也是这个表型，结果发现自发肺转移中的一小部分癌细胞表现出共同表达VIM和E-cad的混合EMT表型。在MDA-MB-231实验性转移中（应该就是模拟转移灶）观察到类似的VIM+/Ecad+细胞，表明MDA-MB-231细胞在远处转移位点经历部分MET以获得混合EMT特征。

图片.png

接着作者染了一下CD44和CD104，尾静脉注射2周后，MLL3突变MDA-MB-231肺转移灶中CD44+ CD104 - high细胞数量约为对照转移灶的两倍。MLL3缺失也增加了Trp53 null/Pik3ca H1047R MaSC类器官和肺转移中VIM+/Ecad+混合EMT细胞的频率。

小背景：混合EMT CD44+CD104high，而完全间充质细胞为CD44+ CD104 low。

小理解：这儿就是用marker和表型都证明了转移灶中，MLL3缺失导致了混合EMT的产生

图片.png

然后作者就尝试解释一下远处转移定植时候的机制，他们人远处转移中发生的MET可能是由转移微环境的间质信号驱动的（在肺中尚未明确定义）。促进MET的一个信号通路是蛋白激酶A （protein kinase A（PKA））。

作者测试了MLL3确实是否可以促进PKA诱导的MET。经过PKA激活剂forskolin（真是毛喉素）处理后，MLL3缺失肿瘤组织中产生的CD44+ CD104 high 的杂交EMT细胞较WT型显著增加（3倍）。同时，forskolin仅使MLL3缺失细胞中 的上皮标记物E cad出现了上调，VIM的下调没有明显变化。

图片.png

小结论：这些结果表明MLL3的缺失促进了混合EMT状态的获得。

证明了MLL3缺失会产生混合EMT，那么MLL3缺失的混合EMT的定植能力会不会更牛呢？

作者就从MLL3-wt或MLL3缺失的MDA-MB-231细胞中筛选出CD44+ / CD104high杂交EMT细胞和CD44+ / CD104 low 的间充质细胞，并通过实验转移进行评估。

结果显示MLL3缺失的混合EMT细胞显示出明显高于其他细胞类型的肺转移启动能力（a-c）。(CD104high说明比较偏向于混合EMT，可能更加容易转移)

图片.png

MLL3缺失的杂交细胞也显著增加了转移到其他多个器官的能力，包括骨、肝和肾（d,e展示的是骨转移的情况，附图偷懒）。此外，与其他细胞类型相比，MLL3突变杂交细胞表现出明显更高的肿瘤启动能力和更快的肿瘤生长（f，附图偷懒）。

图片.png

小结果：MLL3缺失诱导的杂交EMT增加了多器官转移和肿瘤启动能力。

MLL3 loss facilitates EMT and metastasis in luminal cancer

MLL3确实促进腔内癌的EMT和转移

目的：为了确定MLL3的缺失是否促进了上皮细胞的上皮-间充质可塑性

本研究中，作者引入了腔内乳腺癌细胞系MCF7，并敲掉了MLL3。

MCF7
细胞描述：人乳腺癌细胞 MCF7 保留了分化乳腺上皮的许多特性。包括：能通过胞质雌
激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物（domes）。该细胞含有 WNT7B 癌基因。肿
瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制 MCF-7 细胞生长。细胞经抗雌激素处理后能调节
胰岛素样生长因子结合蛋白 IGFBPS 分泌。

虽然MLL3缺失在贴壁培养中没有导致明显的EMT表型（不太清楚这儿是如何说的，大概就是没有出现形态的变化？），但它显著增加了球形形成能力，这是与经历EMT的细胞相关的特性。同时，MLL3突变的MCF7球含有明显更高频率的缺乏上皮标志物CD24的细胞（往间充质转化了？）。另外，这些CD24 -细胞比CD24+细胞具有更高的成球能力（附图偷懒）。

图片.png

此外，MLL3突变球显著上调了VIM和EMT的TF（SLUG和SNAIL），同时维持了上皮标志物E-cad和CD104的表达，表明这些细胞部分发生了EMT。在另一种腔内乳腺癌细胞系T47D中，MLL3缺失同样增加了球的形成和CD24 -和VIM+细胞的数量。

T-47细胞是由I. Keydar分离自一位54岁乳房乳腺浸润性导管癌女性患者胸水。T-47D细胞是T-47细胞的的上皮分化亚株，被发现有细胞质连接和17-β-雌二醇及其他类固醇降血钙素的受体，表达WNT7B癌基因。T-47D细胞可以用于乳腺癌研究，也是一种合适的转染宿主。

图片.png 图片.png

我们进一步测试了MLL3的缺失是否增强了永久化人乳腺上皮（HMLE）细胞中EMT对TGF-β的响应，这是TGF-β诱导EMT的典型模型。通过诱导CD44 high CD24 low 间充质细胞可以看出，低浓度TGF-β1可以让MLL3突变HMLE细胞更快高效发生EMT。

HMLE：人正常乳腺细胞

图片.png

在体内，MLL3缺失显著加速了MCF7肿瘤的发生和生长。此外，mll3突变的肿瘤表现出Ecad表达减少和粘附连接紊乱，与mll3突变MCF7球的部分EMT表型一致。此外，mll3突变MCF7细胞在尾静脉注射后发生的转移明显多于WT细胞。

图片.png

这些结果表明，MLL3的缺失使腔内癌细胞获得混合EMT特性，并变得更具转移性

MLL3 loss activates the IFN-γ pathway

MLL3缺失激活IFN-γ通路

然后就是要看MLL3确实如何激活混合EMT的，看了一下MCF7中WT和MLL3缺失的转录组情况。

干扰素-γ（IFNγ）、干扰素-α（IFNα）和肿瘤坏死因子-α（TNFα）信号是MLL3缺失后富集的signature。MLL3缺失也增加了MDA-MB-231细胞中的IFNγ基因特征（图6b）。

此外，从福斯科林处理过的MDA-MB-231细胞中分选出来的杂交EMT细胞IFNγ基因表达的明显高于间充质细胞。匠心途径分析（IPA）确定IFNγ是杂交EMT细胞中的上游细胞因子调节因子。

图片.png

一些干扰素调节因子（IRF1, IRF2, IRF3, IRF5和IRF7）和STAT1也被发现在混合EMT细胞中被鉴定为活性TF调节因子(图6e)。这些结果表明，混合EMT状态与较高的IFNγ通路活性相关，而IFNγ通路活性因MLL3损失而上调。

图片.png

IFNγ signalling is required for hybrid EMT and metastasis

IFNγ信号是混合EMT和转移需要的

我们测试了炎症因子的功能作用，发现IFNγ可以在MCF7贴附培养中显著增加了CD24 -细胞的频率。说明IFNγ在混合EMT诱导中具有独特的作用。（IFNα、TNFα没有情况）

此外，在IFNγ处理后，MLL3缺失的MCF7细胞比WT细胞更有效地下调上皮标志物CD24，支持MLL3的缺失提升了对IFNγ的反应的敏感性。

对照MCF7球中IFNγ处理使CD24 -细胞的频率增加到mll3突变球的频率。

相反，使用IFNGR1阻断抗体抑制IFNγ信号，降低了mll3突变球体中CD24 -细胞的频率。

慢病毒CRISPR缺失IFNGR1同样降低了CD24 -细胞的频率和mll3突变细胞的成球效率。

图片.png

IFNGR1缺失也消除了MLL3缺失对加速MCF7肿瘤发病的影响(图6j)。

IFNGR1 deletion also abolished the effect of MLL3 loss on accelerating MCF7 tumour onset (Fig. 6j).

此外，通过EMT标记物和肿瘤组织学测量，IFNGR1缺失降低了mll3突变MCF7肿瘤的EMT表型(图6k和扩展数据图6g-i)。

Additionally, IFNGR1 deletion diminished EMT phenotypes in MLL3-mutant MCF7 tumours, as measured by EMT markers and tumour histology (Fig. 6k and Extended Data Fig. 6g–i).

挖个巨坑，啥时候想起来填吧。