【现学现卖】由cDNA产生IPNV病毒（dsRNA病毒侵染性克隆

传染性胰腺坏死病毒——IPNV（infectious pancreatic necrosis virus ）病毒是一种侵染鱼类的dsRNA病毒（Birnaviridae科，同科的另一种病毒为IBDV（infectious bursal disease virus）文章后面的实验也会用）。下面来了解一下论文的实验。

IPNV基因组由segment A（3,097 bp，主要编码结构蛋白VP2和VP3）和B（2,784 bp，编码VP1，担任IPNV中的RdRp）构成，文章用IPNV-WB毒株测定了基因组两端序列，建立了IPNV的反向遗传系统；并且构建了（IPNV-A）+（IBDV-B）和（IBDV-A）+（IPNV-B）的侵染克隆对鲑鱼胚胎细胞和非洲绿猴肾细胞进行转染（异源RdRp），以研究RdRp的专一性（这个结果是，IPNV或IBDV的RdRp只能给它们自己用，具有专一性）。

我主要看了dsRNA病毒侵染克隆构建，以segment A为例：

（1）首先设计引物，可以将segment A分段扩增出来。

（示意图，是IBDV的引物位置，不过IPNV类似）

（2）将3个扩增的片段连入载体pCR2.1，得到pCR#8，pCR#11和pCR#23质粒。对质粒进行测序，确认序列正确。

（3）双酶切上述3个质粒，得到3个两端带有限制性酶切位点的扩增片段。将它们连接到pUC19载体上，得到含有segment A的质粒pUC19WBA，同理对于segment B得到pUC19WBB。

（4）将pUC19WBA和pUC19WBB质粒酶切，做为线性模板，用于T7 RNA聚合酶作用的体外转录。转录产物用DNA，RNA酶处理后用于细胞转染。

文献详情见：

Yao, Kun, and Vikram N. Vakharia. "Generation of infectious pancreatic necrosis virus from cloned cDNA." Journal of virology 72.11 (1998): 8913-8920.