10X单细胞（10X空间转录组）CNV分析之inferCNVpy

隔离的第七日，孤独如影随形，必须写一些内容来排解心中的无聊，上一篇我们详细回顾了copyCAT，文章在10X单细胞（10X空间转录组）CNV分析回顾之CopyKAT，还有分享的文章copyKAT推断单细胞转录组肿瘤细胞CNV（自动识别肿瘤normal和tumor），但是copyCAT的引用率还是比较低，相比于inferCNV 2000多的引用率，还是差很多，所以，inferCNV还是主流，我们这一篇就来回顾一下。

图片.png

其实inferCNV已经是非常老的一个软件了，14年就发表了文章，所以我们来分享其最新的python版本。

加载,与scanpy无缝衔接

import scanpy as sc
import infercnvpy as cnv
import matplotlib.pyplot as plt

sc.settings.set_figure_params(figsize=(5, 5))

Loading the example dataset

前处理

• 应该已经过滤掉低质量的细胞，并且必须对输入数据进行归一化和对数转换
• 此外，基因组位置需要存储在 adata.var 中。 染色体、开始和结束列分别保存每个基因的染色体以及该染色体上的开始和结束位置。
• Infercnvpy provides the infercnvpy.io.genomic_position_from_gtf() function to read these information from a GTF file and add them to .

adata = cnv.datasets.maynard2020_3k()
adata.var.loc[:, ["ensg", "chromosome", "start", "end"]].head()

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sc.pl.umap(adata, color="cell_type")

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Running infercnv

现在运行 infercnvpy.tl.infercnv()。 本质上，该方法通过染色体和基因组位置对基因进行分类，并将基因组区域的平均基因表达与参考进行比较。 原始的 inferCNV 方法使用 100 的窗口大小，但更大的窗口大小可能有意义，具体取决于数据集中的基因数量。

infercnv() adds a cell x genomic_region matrix to adata.obsm[“X_cnv”].

Choosing reference cells(最为关键的一步)

• 最常见的用例是将肿瘤与正常细胞进行比较。 如果有关于哪些细胞正常的先验信息（例如，来自基于转录组学数据的细胞类型注释），建议将此信息提供给 infercnv()。
• 可以提供的不同细胞类型越多越好。 一些细胞类型在生理上过度表达某些基因组区域（例如浆细胞高度表达基因组相邻的免疫球蛋白基因）。 如果提供多种细胞类型，则仅考虑与所有提供的细胞类型不同的区域受 CNV 影响。
• 如果不提供任何参考，则使用所有细胞的平均值，这可能适用于包含足够肿瘤和正常细胞的数据集。

# We provide all immune cell types as "normal cells".
cnv.tl.infercnv(
    adata,
    reference_key="cell_type",
    reference_cat=[
        "B cell",
        "Macrophage",
        "Mast cell",
        "Monocyte",
        "NK cell",
        "Plasma cell",
        "T cell CD4",
        "T cell CD8",
        "T cell regulatory",
        "mDC",
        "pDC",
    ],
    window_size=250,
)

现在，可以按细胞类型和染色体绘制平滑的基因表达。 可以观察到主要由肿瘤细胞组成的上皮细胞cluster似乎受到拷贝数变化的影响。

cnv.pl.chromosome_heatmap(adata, groupby="cell_type")

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Clustering by CNV profiles and identifying tumor cells

为了对细胞进行聚类和注释，infercnvpy 反映了 scanpy 工作流程。 以下函数与它们的 scanpy 对应函数完全一样，除了它们使用 CNV 配置文件矩阵作为输入。 使用这些函数，可以执行基于图形的聚类并根据 CNV 配置文件生成 UMAP 图。 基于这些聚类，可以注释肿瘤和正常细胞。

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cnv.tl.pca(adata)
cnv.pp.neighbors(adata)
cnv.tl.leiden(adata)

运行 leiden 聚类后，可以通过 CNV 聚类绘制染色体热图。 可以观察到，与底部的clusters相反，顶部的clusters基本上没有差异表达的基因组区域。 差异表达的区域可能是由于拷贝数变异，并且各自的clusters可能代表肿瘤细胞。

cnv.pl.chromosome_heatmap(adata, groupby="cnv_leiden", dendrogram=True)

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UMAP plot of CNV profiles

我们可以将相同的clusters可视化为 UMAP 图。 此外，infercnvpy.tl.cnv_score() 计算一个汇总分数，量化每个cluster的拷贝数变异量。 它被简单地定义为每个cluster的 CNV 矩阵的绝对值的平均值。

cnv.tl.umap(adata)
cnv.tl.cnv_score(adata)

UMAP 图由一大团“正常”细胞和几个具有不同 CNV 分布的较小cluster组成。 除了由纤毛细胞组成的cluster“12”外，孤立的cluster都是上皮细胞。 这些可能是肿瘤细胞，每个cluster代表一个单独的亚克隆。

fig, ((ax1, ax2), (ax3, ax4)) = plt.subplots(2, 2, figsize=(11, 11))
ax4.axis("off")
cnv.pl.umap(
    adata,
    color="cnv_leiden",
    legend_loc="on data",
    legend_fontoutline=2,
    ax=ax1,
    show=False,
)
cnv.pl.umap(adata, color="cnv_score", ax=ax2, show=False)
cnv.pl.umap(adata, color="cell_type", ax=ax3)

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还可以在基于转录组学的 UMAP 图上可视化 CNV 分数和cluster。 同样，可以看到存在属于不同 CNV cluster的上皮细胞subcluster，并且这些cluster往往具有最高的 CNV 分数。

fig, ((ax1, ax2), (ax3, ax4)) = plt.subplots(
    2, 2, figsize=(12, 11), gridspec_kw=dict(wspace=0.5)
)
ax4.axis("off")
sc.pl.umap(adata, color="cnv_leiden", ax=ax1, show=False)
sc.pl.umap(adata, color="cnv_score", ax=ax2, show=False)
sc.pl.umap(adata, color="cell_type", ax=ax3)

图片.png

Classifying tumor cells

基于这些观察，我们现在可以将细胞分配给“肿瘤”或“正常”。 为此，我们在 adata.obs 中添加一个新列 cnv_status。

adata.obs["cnv_status"] = "normal"
adata.obs.loc[
    adata.obs["cnv_leiden"].isin(["10", "13", "15", "5", "11", "16", "12"]), "cnv_status"
] = "tumor"
fig, (ax1, ax2) = plt.subplots(1, 2, figsize=(12, 5), gridspec_kw=dict(wspace=0.5))
cnv.pl.umap(adata, color="cnv_status", ax=ax1, show=False)
sc.pl.umap(adata, color="cnv_status", ax=ax2)

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cnv.pl.chromosome_heatmap(adata[adata.obs["cnv_status"] == "tumor", :])

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The inferCNV method

本质上，这个包是 infercnv 的 Python 重新实现。通过使用 numpy、scipy 和稀疏矩阵，它的计算效率要高得多。

Computation steps

The function parameters are documented at infercnvpy.tl.infercnv()

1、从所有细胞中减去参考基因表达。 由于数据在对数空间中，这有效地计算了对数倍数变化。 如果有多个类别的引用可用（即为 reference_cat 指定了多个值），则log fold change是“bounded”：

• 分别计算每个类别的平均基因表达。
• 在所有参考平均值的最小值和最大值范围内的值会收到 0 的对数倍数变化，因为它们不被视为与背景不同。
• 从小于所有参考平均值的最小值的值中减去该最小值。
• 从大于所有参考平均值的最大值的值中减去该最大值。

此过程避免了由于聚集基因区域（例如不同免疫细胞类型中的免疫球蛋白或 HLA 基因）的细胞类型特异性表达而调用假阳性 CNV 区域。

2、Clip the fold changes at -lfc_cap and +lfc_cap.

3、通过基因组位置平滑基因表达。 计算长度为 window_size 的运行窗口的平均值。 仅计算每第 n 个窗口以节省时间和空间，其中 n = step。

4、通过从每个细胞中减去每个细胞的中位数，按细胞将平滑的基因表达居中。

5、执行噪声过滤。 值 < dynamic_theshold * STDDEV 设置为 0，其中 STDDEV 是平滑基因表达的标准偏差

6、Smooth the final result using a median filter.

Preparing input data

• annadata.AnnData 对象应该已经被过滤为低质量的细胞。 adata.X 需要进行规范化和对数转换。 该方法应该对不同的归一化方法（scanpy.pp.normalize_total()、scran 等）相当稳健。
• 该方法需要一个“参考”值，与基因组区域的表达进行比较。 如果数据集包含不同的细胞类型并且包括肿瘤细胞和正常细胞，则可以使用所有细胞的平均值作为参考。 这是默认设置。
• 如果已经知道哪些细胞是“正常的”，可以提供从 adata.obs 到 reference_key 的列，其中包含注释。 reference_cat 在reference_key 中指定一个或多个引用正常细胞的值。

生活很好，有你更好