发表期刊：Computational and Structural Biotechnology Journal（IF=7.271）
发表时间：2021
研究背景
微生物是生物和环境的营养循环和代谢过程所必需的，并且与生理学至关重要。虽然微生物可以使用传统培养的方法来确定，但目前自然界中可培养的微生物仅为1%。宏基因组能够通过测序从混合DNA中检测不可培养的微生物基因组序列（图1A），通过binning方法，将数据中来自同一菌株的序列聚到一起，得到单个菌株的基因组。
2021年底，发表在《Computational and Structural Biotechnology Journal》期刊的这篇综述详细阐述了宏基因组binning分析中用到的各类工具，给广大生信分析者提供了重要参考。
图1 在宏基因组学研究领域中使用的不同方法的示意图表示
（A）非培养（宏基因组学）方法和依赖于培养的方法之间的示意图对比。（B）基于组装和基于参考数据库方法的宏基因组测序数据之间的对比。
宏基因组项目分析工具
1、序列质控工具
针对短读长测序（如Illumina测序），常用的序列质控工具有FastQC，fastp、Trimmomatic和SOAPnuke（表1）。FastQC提供了碱基质量、GC含量分布和核苷酸偏倚的可视化说明。Fastp通过使用高级的多线程实现，提高了QC处理速度。Trimmomatic和SOAPnuke是分别针对Illumina和BGISEQ测序平台进行优化的最常用的两种工具。
针对长读长测序（如PacBio、Nanopore测序等），由于质控原理不同，相应的工具也有所不同，如SequelTools可通过过滤低质量reads并产生多个统计图，来检查PacBio长读长的质量。
表1 用于序列质控的工具
2、宏基因组组装工具
针对不同测序数据类型，宏基因组组装工具有所不同。传统短读长测序的宏基因组组装工具是基于OLC（overlap-layout consensus）方法设计的，如Omega。还有其他几种使用DBG（De Bruijn graph）设计的工具，如MetaVelvet、MetaVelvet-SL和MEGAHIT。
针对SLR（synthetic long reads）和linked reads测序，分别有Nanoscope、Athena和cloudSPAdes工具。由于PacBio和ONT平台生成的长reads比二代NGS测序具有更高的碱基错误率，针对长读长已经开发了用于碱基错误修正的专用模块，例如Canu和NECAT，使用OLC方法纠正了基因组组装前长序列的测序错误。
短读长和长读长测序技术在某种程度上是互补的，因为短读长具有较高的碱基质量，而长读长提供了连通性。因此，一些算法通过利用两种测序技术的优点开发了新的工具，如DBG2OLC和Opera-MS。
总之，二代宏基因组组装最常用的工具是MEGAHIT，三代宏基因组组装常用是MetaFlye和Canu。
表2 宏基因组组装工具
3、宏基因组组装结果检验工具
有许多工具可用来评估宏基因组组装生成的contigs和scaffolds的准确性和连续性。
● MetaQUAST可以快速计算出连续长度和scaffolds的基本统计数据，如组装长度、N50值和连续长度分布等。
● REAPR可以精确地识别基因组组装中的错误，且不依赖于参考序列。
● VALET在QC之前进行宏基因组binning，以减少由于reads深度不均匀而导致的假阳性和假阴性的数量。
● DeepMAsED可不依赖参考基因组，使用深度学习模型来检测错误组装的序列。
表3 用于组装结果检验的工具
4、宏基因组binning工具
目前的大多数组装工具并不能以单一scaffolds代表完整的微生物基因组。许多宏基因组binning工具被开发出来，将scaffolds分成簇，以代表一个生物体的整个基因组（表4）。Metabat2在众多单样本分箱工具中具有很大优势，从Bin数量、完成度、Bin纯度、精确度、效率上来看，Metabat2表现都十分出色。
表4 宏基因组binning的工具
5、MAGs完整度和污染度评估
CheckM通常用于确定每个bins的质量。然后只选择质量相对较高的bins作为后续注释的MAG。根据其完整性、污染水平和rRNA/tRNA预测，这些bins通常分为高质量、中等质量和其他类型。
表5 MAGs质量评估
6、基因预测工具
隐马尔可夫模型（HMM）是基因预测中最常用的算法。常用工具包括MetaGeneMark，Glimmer-MG和FragGeneScan。
一些针对细菌和古细菌基因组的基因预测工具，使用的是动态编程，例如Prodigal、MetaGen和MetaGeneAnnotator。
此外，各种深度学习工具在基因预测方面得到了相当多的关注，常用的工具有Meta-MFDL和CNN-MGP。
表6 基因预测工具
7、基因功能注释工具
宏基因组基因功能注释工具可分为两类：
1）宽泛功能的工具来评估完整的功能潜力；
2）特定功能的工具，专注于一个或几个特定的生物过程。
基于同源性的工具通常依赖于BLAST来比较预测基因序列与已知基因序列的相似性，这些工具在处理从MAG中预测出的大量基因时通常非常缓慢。而eggNOG-mapper、GhostKOALA、MG-RAST和PANNZER2，采用了优化的比对策略，使基因序列与数据库的比对速度提高100-1000倍。
表7 基因功能注释工具
8、用于MAGs分类学鉴定的工具
注释MAGs时的另一个关键任务是确定它们的分类学地位。传统的基于16S rRNA的分类方法分辨率有限，在MAGs中的代表性较差。相比之下，单拷贝标记基因由于其分辨率的提高而受到欢迎（表7）。
推荐GTDB-Tk软件工具包，该工具基于基因组分类数据库GTDB可以对宏基因组binning获得的单菌基因组（MAGs）进行分类鉴定。
表8 MAGs分类学鉴定工具
9、分析MAGs丰度工具
用来估计宏基因组测序数据中MAGs丰度的具被分为四类：
1）基于蛋白质的工具；
2）基于k-mer的工具；
3）基于标记基因的工具；
4）基于单核苷酸多态性（SNP）的工具。
这四种方法都能估计MAGs丰度，但具有不同的分辨率。例如，基于k-mer的工具计算了MAGs的特定序列的丰度，而基于标记基因的工具计算了分类学丰度。
表9 用于分析MAG丰度的工具
总结
本研究为宏基因组binning上游和下游的分析工具提供了统一的公共资源，读者可以根据自己的研究目标选择最有效的工具和软件应用程序，同时文章内容加速了在宏基因组学领域使用的相关软件、工具等的研究和开发进程。
参考文献
A review of computational tools for generating metagenome-assembled genomes from metagenomic sequencing data. 2021.
DOI:10.1016/j.csbj.2021.11.028
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