改造工程菌插入外源基因的方法有多种：
大肠杆菌Red同源重组原理
PhiC31定点插入转基因及应用案例
Red/ET重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统
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本文主要介绍基于Tn5转座酶的方法
转座酶通过形成二聚体转座酶、转座子 DNA 复合物启动转座。在该复合物中，转座酶催化四个磷酸转移反应（DNA 挑刺、DNA 发夹形成、发夹分解和链转移到目标 DNA），从而将转座子整合到新的 DNA 位点。
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下面从文献中挖掘信息，旨在明确Tn5转座子
文献1：
pBAM1: an all-synthetic genetic tool for analysis and construction of complex bacterial phenotypes
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核心的元件整理如下
1. Transposase (tnpA)
The Tn5 transposase recognizes both end-sequences and catalyzes the transfer
of the mobile module from the donor replicon to the target genome,
原始的Tn5片段长，酶活低，作者团队之前通过设计优化了其序列，改造为mini hyperactivity tnpA
2. origin of replication (R6K)
oriV复制子依赖于 π protein (encoded by the pir gene of R6K)，所以如果想要此质粒得以复制。This makes replication of any covalently close circular (ccc) DNA bearing such an oriV entirely dependent on the provision of the p protein, either from a second plasmid or from the chromosome.
S17-1(Lambdapir) strain宿主菌就是第二种，染色体上整合了RP4-2质粒。
由于缺乏 p 蛋白，通过共轭或电穿孔转移到受体的质粒在任何情况下都无法复制，因此这一过程被称为自杀式传递。
3. The origin of transfer region (oriT)
在细菌接合过程种，在Tra蛋白的作用下，可以转移pBAM1质粒到受体菌中。
4. mosaic element O (ME-O)
hyperactive 19-bp mosaic sequence (ME)，是转座酶识别并将其整合到染色体的序列。
5. antibiotic marker
抗性标记，Ap, ampicillin用于质粒提取筛选， Km,kanamycin是发生转座进入受体菌后，可以筛选的标记。
现在已经有将辅助质粒细菌所需的元件都整合到了受体菌染色体中，并制备成感受态。
S17-1(Lambdapir) strain宿主菌
基因型：RP4-2(Km::Tn7,Tc::Mu-1), pro-82, LAMpir, recA1, endA1, thiE1, hsdR17, creC510
S17-1 λpir菌株的染色体中整合了RP4-2质粒，该质粒可以携带染色体的部分DNA在接合菌株之间转移。 S17- 1 λpir菌株缺失核酸内切酶 (endA1)，提高了质粒DNA的产量和质量；同时为重组酶缺陷型 (recA1)，减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA 的稳定性。Tn7赋予该菌株弱的链霉素抗性。
文献2：
Transposase-Mediated Chromosomal Integration of Exogenous Genes in Acidithiobacillus ferrooxidans
TnpA进一步改造为hyperactive Tn5 transposase
根据文献的引物和克隆描述，笔者推导出来的pBAM2载体图谱：
pBAM2
pBAM2-GFP
参考资料：
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