遗传转化-叶盘法
预培养:选取5叶期本氏烟生长较肥厚的叶片,用无菌水冲洗数遍后,用70 %乙醇表面消毒1min,25%的次氯酸钠消毒2-3min,再用无菌水冲洗数遍,无菌滤纸吸干表面水分,再用手术刀切成1cm2小块,置于含有6-BA(2 mg/L)的MS培养基上进行预培养2-3d。
共培养:菌体用100ml MS+200μl AS(100μg/ml)重新悬浮30min,取出预培养后的烟草叶片,放入MS悬浮后的农杆菌液中浸泡约10min,并不间断的轻轻晃动,之后取出叶片置于无菌滤纸上吸干,放入含有6-BA
(3mg/L)、NAA(0.2 mg/L)、AS(100μM)的共培养的培养基上26℃暗培养2-3d。
筛选培养:将共培养后的叶片取出,用无菌水清洗数遍,无菌滤纸吸干残余的水分,至于含抗生素(Carb和Hyb)的MS筛选培养基上进行选择培养,每两周筛选培养一次。
生根培养:待小芽长到1cm以上时,切去芽基部的愈伤组织,转移到含有(Carb和Hyb)的1/2MS生根培养基上培养。
待幼苗生根后,轻轻拔出,洗去根部的琼脂,移栽到土壤中,先在阴暗处练苗1-2d使其适应外界环境后再转移到正常环境下光照培养。
网友评论