今天给大家分享一篇2021年12月发表在Front Cell Dev Biol（Q1，IF=6.684）的文章。
人视网膜色素上皮的单细胞转录组图谱
主要干了啥？
作者通过单细胞RNA测序，确定了两个在基因表达模式和功能上表现出巨大差异的人类视网膜色素上皮（hRPE）细胞亚群，黄斑视网膜色素上皮（RPE）和外周RPE，与氧化应激和内质网应激相关的基因在黄斑RPE中高度表达，而与光感、氧化应激和脂质代谢相关的基因在外周RPE中更为丰富。作者提供了hRPE中眼部疾病相关基因的图谱，并强调了黄斑RPE和外周RPE的P4和P6亚群作为视网膜疾病潜在治疗靶点的重要性。
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背景和研究动机
在人类和灵长类动物视网膜的后极附近有一个直径为2.5-3毫米的浅漏斗状凹陷，称为黄斑或黄斑。黄斑的中央凹陷称为中央凹，其中视网膜最薄，只有两层细胞：RPE和锥体细胞。许多导致失明的眼部疾病，如年龄相关性黄斑变性（AMD），主要影响中央凹，这表明研究视网膜，特别是黄斑的细胞功能具有重要意义。
在单细胞水平上已经有许多研究报道了人类和其他灵长类动物的视网膜细胞亚群，人类RPE细胞的异质性和详细的分子图谱尚未得到很好的研究。然后作者认为虽然有许多研究阐述了RPE细胞的重要功能和特性，但尚未在hRPE细胞中区分精确的细胞类型。因此，有必要探索hRPE细胞的异质性和分子图谱，以阐明hRPE相关视网膜疾病的发病机制，并为这些疾病发现更多的治疗方法。
结果
建立hRPE单细胞转录组图谱
在本研究中，作者从三名捐赠者（年龄29-64岁）获得成人hRPE样本，构建具有hRPE细胞的单细胞转录组图谱（图1）。产生高质量细胞图谱的hRPE细胞图谱分为两个群体：一个群体有8863个细胞，另一个群体有439个细胞。两个群体都表达RPE标记基因，如PAX6和BEST1。先前的转录组研究（Voigt等人，doi:10.1073/pnas.1914143116）表明，ID3和IGFBP5分别在hRPE细胞的黄斑区和外周区高度表达。而作者恰巧发现ID3的特异性表达仅限于其中一簇包含少数细胞的群体（439个细胞），而IGFBP5在另一个群体（8863个细胞）中高度富集。因此，作者假定一个簇是黄斑RPE，另一个簇是外周簇。两者的基因表达不同（三个样本结果相似），并对这些基因进行Gene Ontology (GO)通路富集分析。外周RPE细胞和黄斑RPE细胞在质子跨膜转运、内质网应激和ATP代谢过程中可能存在显著差异。
图1 hRPE的单细胞RNA-seq转录组分析
人黄斑RPE细胞亚群的分析
作者探究了黄斑RPE细胞的异质性，发现根据基因表达谱可将黄斑RPE细胞分为两个亚群（M1和M2簇）（图2A、B）。差异表达分析显示，在三个样本中，不仅两个亚群的差异表达基因显示出相似的表达模式（图2B-D），而且两个亚群的统计比例非常相似（图2E、F）。进一步GO分析表明，M1簇富含细胞粘附和细胞连接，M2簇主要富含疾病或创伤引起的氧化应激和内质网应激（图2G）。也就是说，黄斑RPE也可分为执行不同功能的较小亚群。
图2 黄斑RPE的单细胞RNA-seq转录组分析
人外周RPE细胞亚群及表达谱
当然，作者也进一步分析了外周RPE细胞群。根据基因表达差异，外周RPE细胞可分为8个亚群。同样，三个样本具有相似的基因表达模式和亚群比例。接下来，GO安排上，显示8个亚群功能各异。这也是首个人类视网膜外周RPE细胞的转录组分析。
作者返回去审查了自己的hRPE细胞差异基因表达结果，发现IGFBP5的特异性较低，而对比差异表达基因的RT-PCR分析结果，外周RPE中CRYAB比IGFBP5更具特异性，可以作为外周RPE的新标记基因（Dear Dr. Voigt, 外周RPE的标记基因更新啦~ 虽然看热闹不嫌事儿大，但ID3的地位还是稳固的）。
图3 外周RPE的单细胞RNA-seq转录组分析
黄斑RPE与外周RPE的基因表达模式差异
转录因子是RPE发育所必需的，作者分析了每个细胞中基因调控网络的活动。检测转录因子活性（？为什么能这么做，因为有前人报道：在特定细胞类别中50%以上的细胞中活跃的转录因子被保留（Hu等人，doi:10.1371/journal.pbio.3000365））的结果显示，黄斑RPE与外周RPE中转录因子具有高度活性（图4A、B）。NFIB在外周hRPE细胞中高表达；IRX3、FOXP1、KLF2、TWIST1和PBX1在黄斑hRPE细胞中高表达；它们被认为是活性转录因子，各自靶基因参与特定生物学过程（图4C）。大多数转录因子活跃在黄斑RPE，提示黄斑RPE在视网膜发育过程中可能在RPE细胞的分化中起重要作用。
但是，黄斑RPE一个“人”就能完成“任务”吗？当然不！作者分析了外周和黄斑细胞群之间的相互作用（图4D、E）。检测亚群之间受体-配体对的结果显示，前20个受体-配体对中有17个在黄斑RPE中富集，这表明黄斑RPE簇与视觉系统发育密切相关。以上的结果揭示了hRPE中转录因子的表达模式，以及RPE亚群之间的相互作用，这两者都表明黄斑RPE在视觉发育中的重要性（外周RPE不要难过，分量虽小，不可或缺）。
图4 黄斑RPE和外周RPE之间的不同基因表达模式
hRPE的发育及其动态转录组特征
接下来，作者探究了外周RPE和黄斑RPE簇的转录组动力学，绘制出发育轨迹（图5A-C和E）。在黄斑RPE中，M1簇细胞处于发育早期，M2簇细胞处于发育晚期。在外周RPE中，亚群具有特定的发育顺序。进一步的研究还发现，黄斑RPE和外周RPE的特异转录因子的表达，包括IRX3、TWIST1、FOXP1、KLF2、PBX1和NFIB，沿伪时间轴发生变化（图5D-F）。例如，在黄斑RPE中IRX3、TWIST1、FOXP1、KLF2和PBX1的表达逐渐降低。NFIB在外周RPE中的表达也逐渐降低。
图5 人类外周RPE和黄斑RPE的发育
人类视网膜疾病相关基因特异性表达模式的分析
作者使用RetNet数据库（https://sph.uth.edu/retnet/）识别与视网膜疾病相关的基因，并确定了这些基因在作者的数据中的聚类分布。作者发现一些已知的与视网膜疾病相关的基因在不同细胞簇中分别高表达（图6）。在以前的研究中，与AMD相关的VTN和HTRA1分别在视网膜的光感受器细胞（视杆和视锥）细胞和水平细胞中高度表达。有趣的是，在作者的hRPE数据中，VTN和HTRA1基因在外周RPE的P2和P7细胞簇中高度表达（补充图S3C）。此外，与AMD相关的其他视网膜疾病致病基因主要表达在P4、P6和P7细胞簇中，但一些易感基因，如C2、FBLN5和TLR4，在黄斑RPE中高度表达。作者分析了亚群中与眼部疾病相关的基因表达，发现许多人类视网膜疾病主要影响黄斑RPE和一些外周RPE，如簇P4和P6。
图6黄斑和外周细胞类型中疾病相关基因的聚集表达
补充图S3
以上这些结果确定了RPE中多个眼部疾病相关基因的亚群分布，并可能为未来的遗传相关分析和疾病治疗提供信息。
讨论
单细胞测序技术有助于详细分析许多复杂组织的细胞类型和基因表达模式。这篇文章中，作者基于三个样本的hRPE细胞进行单细胞测序，探究了RPE的异质性，包括细胞分类和功能差异。许多眼部疾病如AMD和色素性视网膜炎与黄斑视网膜密切相关，尤其是视网膜神经节细胞、视锥细胞和视杆细胞；然而，作者的结果表明，许多与这些疾病相关的易感基因在特定的黄斑RPE亚群中选择性表达。hRPE细胞亚群在这些疾病中的发病机制有待进一步探讨。由于hRPE细胞的异质性以及年龄对其异质性的影响，需要进一步的研究来阐明hRPE簇的生理和病理功能。
小编有话说
这篇文章看下来，或许给人的感觉可能是：…那我也可以。毕竟方法都是我们耳熟能详的聚类、功能富集、PCR等等。但是，小编说过，方法其实没那么重要，用对的就行，关键是研究思路。单细胞的landscape文章可能已经比较普遍，但是仍然有被挖掘和发现的潜力，这一点毋庸置疑。
随着科学技术和人类医学研究的不断进步，单细胞群体的神秘面纱正在慢慢被揭开，这也就意味着单一的单细胞RNA测序文章想发高分杂志已经比较困难。这篇文章基本算是单细胞分析比较“保守”的思路了，自测单细胞landscape的常规分析可能就是这个水平，如果从不一样的角度进行分析和挖掘，相信会better。
还有重要的一点，不要担心没有自测单细胞数据，请坚持相信公共数据有宝藏（点击~）。不要犹豫，联系我们。我们不生产数据，我们只是数据的挖掘机。
题外话：这篇文章虽然只有三个样本（人类的眼睛样本其实真的很宝贵），但作者两次阐述了他们发现的现象在三个样本中是高度一致的，无形中给审稿人和我们灌输了结果是真的、对的、可信的、是事实（没有质疑的意思）的理论，仅仅一句“…similar among samples”就体现出了作者的自信。虽然写文章避免车轱辘话来回说，但业界还是存在不少这样的现象。“少即是多”，这样的写作方法值得借鉴，更多思路干货点击获取。
参考文献
1、A Single-Cell Transcriptome Atlas ofthe Human Retinal Pigment Epithelium
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