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官方说明：https://www.internationalgenome.org/wiki/Analysis/vcf4.0/
更多说明：
https://cloud.tencent.com/developer/article/1607926
https://www.jianshu.com/p/b2b30b23c866
https://zhuanlan.zhihu.com/p/519356332

一、注释部分

“#”开头的注释部分，包含对VCF的介绍信息

##fileformat=VCFv4.2
##fileDate=20211116
##source=freeBayes v1.3.4
##reference=genome.fasta
##contig=<ID=Chr01,length=70190195>
##contig=<ID=Chr02,length=25710898>
##contig=<ID=Chr04,length=25286349>
##contig=<ID=Chr05,length=24731975>
......
##commandline="freebayes -f genome.fasta --use-best-n-alleles 3 --min-mapping-quality 20 merge.bam 
##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of samples with data">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total read depth at the locus">
##INFO=<ID=DPB,Number=1,Type=Float,Description="Total read depth per bp at the locus; bases in reads overlapping / bases in haplotype">
##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description="Total number of alternate alleles in called genotypes">
##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description="Total number of alleles in called genotypes">
##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description="Estimated allele frequency in the range (0,1]">
##INFO=<ID=RO,Number=1,Type=Integer,Description="Count of full observations of the reference haplotype.">
......

二、主体部分

[0]CHROM    [1]POS    [2]ID    [3]REF    [4]ALT    [5]QUAL    [6]FILTER    [7]INFO    [8]FORMAT    [9]SAMPLES
[0]Chr05    [1]20000355    [2].    [3]A    [4]G    [5]51.3669   [6].    [7]AB=0;ABP=0;AC=6;AF=0.428571;AN=14;AO=4;CIGAR=1X;......TYPE=snp    [8]GT:DP:AD:RO:QR:AO:QA:GL [9]1/1:1:0,1:0:0:1:37:-3.69783,-0.30103,0

• [0] CHROM ： 参考序列名称，表示变异位点是在哪个contig/chr里call出来的。
• [1] POS： 变异位点（variant）相对于参考基因组所在的位置，发生变异的位置的第一个碱基所在的位置）。
• [2] ID：variant的ID，如call出来的SNP存在于dbSNP数据库里，就会显示相应的dbSNP里的rs编号，若没有，则默认使用‘.’。
• [3] REF：参考序列的Allele，（等位碱基，即参考序列该位置的碱基类型及碱基数量）。
• [4] ALT：变异位点的Allele，若有多个，则使用逗号分隔，（变异所支持的碱基类型及碱基数量）这里的碱基类型和碱基数量，对于SNP来说是单个碱基类型的编号，而对于Indel来说是指碱基个数的添加或缺失，以及碱基类型的变化。
• [5] QUAL：可以理解为变异位点的质量值。Q=-10lgP，Q表示质量值，P表示这个位点发生错误的概率。因此，如果想把错误率控制在10%，P的阈值就是1/10，那lg（1/10）=-1，Q=（-10）*（-1）=10。同理，当Q=20时，错误率就控制在了0.01。
• [6] FILTER：理想情况下，QUAL这个值应该是用所有的错误模型算出来的，这个值就可以代表正确的变异位点了，但这是做不到的。因此，还需要对原始变异位点做进一步的过滤。FILTER，即过滤记录，PASS代表通过了filter，“.”代表没有进行任何过滤。
• [7] INFO ： 变异位点的相关信息
• [8] FORMAT：变异位点的格式，例如GT:AD:DP:GQ:PL
• [9] SAMPLES ： 各个Sample的值，由BAM文件中的@RG下的SM标签所决定，这些值对应着FORMAT列的各个格式，不同格式的值用冒号分开，每一个sample对应着1列；多个samples则对应着多列。

三、FORMAT列详解

（一）GT ： genotype

• 样品的基因型（genotype），两个数字中间用‘/’分开，两个数字表示双倍体的sample的基因型。0表示样品中有ref的allele（可初步理解为和ref的碱基相同，即和REF相同）；1表示样品中的variant的allele（可以理解为和variant变异后的碱基相同，即和ALT相同）；2表示有第二个variant的allele（和ALT的第二种碱基相同）对于SNP是指单个碱基类型相同而对于Indel是指碱基类型及个数均相同

0/0表示sample中该位点为纯合位点，和REF的碱基类型一致
0/1表示sample中该位点为杂合突变，有REF和ALT两个基因型（部分碱基和REF碱基类型一致，部分碱基和ALT碱基类型一致）
1/1表示sample中该位点为纯合突变，总体突变类型和ALT碱基类型一致
1/2表示sample中该位点为杂合突变，有ALT1和ALT2两个基因型（部分和ALT1碱基类型一致，部分和ALT2碱基类型一致）

（二）AD和DP

• AD(Allele Depth)为sample中每一种allele（等位碱基）的reads覆盖度，在diploid（二倍体，或可指代多倍型）中则是用逗号分隔的两个值，前者对应REF基因，后者对应ALT基因型。
• DP(Depth)为sample中该位点的覆盖度，是两个AD值的加和。覆盖到这个位点的总的reads数量，相当于这个位点的深度（并不是多有的reads数量，而是大概一定质量值要求的reads数）。

例：GT:AD(REF),AD(ALT):DP  1/1:0,175:175

（三）GQ

• 基因型的质量值（Genotype Quality）。Phred格式（Phred_scaled）的质量值，表示在该位点该基因型存在的可能性；该值越高，则Genotype的可能性越大；计算方法：Phred值=-10*log(1-P)，P为基因型存在的概率（一般在final.snp.vcf文件中，该值为99，为99时，其可能性最大）。
• QUAL和GQ的区别：
  1、QUAL，Phred格式(Phred_scaled)的质量值，表示在该位点存在variant的可能性；该值越高，则variant的可能性越大；计算方法：Phred值 = -10 * log (1-p) p为variant存在的概率; 通过计算公式可以看出值为10的表示错误概率为0.1，该位点为variant的概率为90%。
  2、GQ，基因型的质量值(Genotype Quality)。Phred格式(Phred_scaled)的质量值，表示在该位点该基因型存在的可能性；该值越高，则Genotype的可能性越大；计算方法：Phred值 = -10 * log (1-p) p为基因型存在的概率。
  GQ告诉我们对分配给特定样品的基因型正确的概率有多大。
  QUAL是指变异位点，而GQ是指特定样品的GT。
  QUAL告诉我们对于给定位点是否存在变异，该变异可以存在于一个或多个样本中。
  也就是QUAL是针对该位点的，和样本无关，只是说明这个位点存在变异的可能性，而GQ是和样本相关的，它表示该样本基因型的可能性。

（四）PL（likelihood genotypes）

对应3个以逗号隔开的值，这三个值分别表示该位点基因型是0/0，0/1，1/1的没经过先验的标准化Phred-scaled似然值（L）。这个值越小，概率就越大，即这个基因型的可能性越大。

四、INFO列详解

• 第8列的信息包括18种，都是以“TAG=Value”，并使用分号分隔的形式，其中大多在VCF文件的头部注释中给出

（一）AC，AF和AN

• AC：variant数目，AF：频率，AN：总数目

AC（Allele Count）表示与variant一致的Allele（等位碱基）的数目
AF（Allele Frequency）表示Allele的频率，AF值=AC值/AN值
AN（Allele Number）表示Allele的总数目。

（二）DP

• 表示过滤后的reads覆盖度。

（三）FS

• FisherStrand，表示使用Fisher’s精确检验来检测strand bias，得到的Fhred格式的p值，该值越小越好；如果该值较大，表示strand bias（正负链偏移）越严重，即所检测到的variants位点上，reads比对到正负义链上的比例不均衡。
  一般进行filter的时候，推荐保留FS<10~20的variants位点。GATK可设定FS参数。

（四）ReadPosRandSum

• 当variants出现在reads尾部的时候，其结果可能不准确。该值用于衡量alternative allele，相比于reference allele，variant位点是否匹配到reads更靠中部的位置。
  因此只有基因型是杂合且有一个allele和参考基因组一致的时候，才能计算该值。
  1、若该值为正值，表明和alternative allele相当于reference allele，落来reads更靠中部的位置
  2、若该值是负值，则表示alternative allele相比于reference allele落在reads更靠尾部的位置。
  进行filter的之后，推荐保留ReadPosRankSum>-1.65~-3.0的variant位点。

（五）MQRankSum

• 该值用于衡量alternative allele上reads的mapping quality与reference allele上reads的mapping quality的差异。若该值是负数值，则表明alternative allele比reference allele的reads mapping quality差。
  进行filter的时候，推荐保留MQRankSum>-1.65~-3.0的variant位点。