配置文件
cat /opt/biosoft/Misa_Primer3/p3_settings_from_chenlianfu.txt
Primer3 File - http://primer3.sourceforge.net
P3_FILE_TYPE=settings
P3_FILE_ID=P3 Settings from Lianfu Chen
PRIMER_FIRST_BASE_INDEX=1
PRIMER_TASK=generic #确定primer3设计的引物类型
PRIMER_NUM_RETURN=5 # 最大返回的引物数目
PRIMER_PICK_LEFT_PRIMER=1 #是否设计左引物
PRIMER_PICK_INTERNAL_OLIGO=0 #是否设计探针
PRIMER_PICK_RIGHT_PRIMER=1 #是否设计右引物
PRIMER_PICK_ANYWAY=1 #
PRIMER_THERMODYNAMIC_PARAMETERS_PATH=/opt/biosoft/primer3-2.4.0/src/primer3_config/
### 引物 TM 值设定: ###
PRIMER_TM_FORMULA=1 # TM 的计算方法， 1 表示使用 the SantaLucia parameters (Proc Natl Acad Sci 95:1460-65)
PRIMER_MIN_TM=55.0 #退火温度
PRIMER_OPT_TM=60.0
PRIMER_MAX_TM=65.0
PRIMER_PAIR_MAX_DIFF_TM=5.0 # 两个引物之间的 TM 值最多相差 5 摄氏度
PRIMER_WT_TM_LT=0
PRIMER_WT_TM_GT=0
PRIMER_PAIR_WT_DIFF_TM=0.0
### 引物长度设定: ###
PRIMER_MIN_SIZE=18
PRIMER_OPT_SIZE=20
PRIMER_MAX_SIZE=22
PRIMER_WT_SIZE_LT=0
PRIMER_WT_SIZE_GT=0
### 引物 GC 含量设定：###
PRIMER_MIN_GC=30.0
PRIMER_MAX_GC=70.0
PRIMER_WT_GC_PERCENT_LT=0.0
PRIMER_WT_GC_PERCENT_GT=0.0
### 引物的热力学计算: ###
# 开启热力学计算，开启后，根据热力学的值 TH 值来计算罚分。 TH 的罚分方法为：罚分系数 * (1 / (引物TM - 4 - TH值))。
# 该方法好处是，TH 值越大，罚分力度越重。
PRIMER_THERMODYNAMIC_OLIGO_ALIGNMENT=1 #开启热力学计算
# 引物自身进行反向互补，罚分系数计算为 9 / ( 1/(60-4-45) - 1/(60-4-0) ) = 123.2
# 这样计算罚分系数的原则是，若 TM 为最佳 60 摄氏度的时候，所允许的最大罚分值减去最小罚分值为 9，和 3' 端碱基的稳定性的罚分额度一致。
PRIMER_MAX_SELF_ANY=8.00
PRIMER_WT_SELF_ANY=0.0
PRIMER_MAX_SELF_ANY_TH=45.00
PRIMER_WT_SELF_ANY_TH=123.2
# 引物自身进行 3' 端反向互补形成引物二聚体，罚分系数计算为 9 / ( 1/(60-4-35) - 1/(60-4-0) ) = 302.4
PRIMER_MAX_SELF_END=3.00
PRIMER_WT_SELF_END=0.0
PRIMER_MAX_SELF_END_TH=35.00
PRIMER_WT_SELF_END_TH=302.4
# left primer 和 right primer 序列的反向互补
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY=8.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY=0.0
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY_TH=45.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY_TH=123.2
# left primer 和 right primer 进行 3' 端反向互补形成引物二聚体
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END=3.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END=0.0
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END_TH=35.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END_TH=302.4
# 发夹结构，罚分系数计算为 9 / ( 1/(60-4-24) - 1/(60-4-0) ) = 672
PRIMER_MAX_HAIRPIN_TH=24.00
PRIMER_WT_HAIRPIN_TH=672
# 3' 端碱基的稳定性
PRIMER_MAX_END_STABILITY=9.0
PRIMER_WT_END_STABILITY=1
### 碱基序列设定： ###
PRIMER_LOWERCASE_MASKING=0 # 模板序列中包含小写字符不影响引物设计
PRIMER_MAX_POLY_X=4 # 引物序列中不能包含单核苷酸连续长度超过 4 bp
PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED=0 # 引物中允许的 N 的数目
PRIMER_WT_NUM_NS=0.0 # 每个 N 的罚分
PRIMER_MAX_END_GC=5 # 引物中 3' 端 5bp 碱基中允许的最大 Gs 或 Cs 的数目
PRIMER_GC_CLAMP=0 # 引物中 3' 端碱基中不能出现连续的 Gs 和 Cs 序列
PRIMER_LIBERAL_BASE=1 # 是否允许有诸如 N A R Y 等类型的碱基。必须在设定PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED 不为 0 后方有效。
PRIMER_LIB_AMBIGUITY_CODES_CONSENSUS=0 # 如果设置为 1，则 C 能与 S 完美匹配，任意碱基能和 N 完美匹配。
### 碱基质量设定： ###
PRIMER_MIN_QUALITY=0 # primer 序列允许最小的碱基质量
PRIMER_MIN_END_QUALITY=0
PRIMER_QUALITY_RANGE_MIN=0
PRIMER_QUALITY_RANGE_MAX=100
PRIMER_WT_SEQ_QUAL=0.0
PRIMER_WT_END_QUAL=0.0
## 引物位置设置： ###
PRIMER_SEQUENCING_LEAD=50 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 表明引物的 3' 端距目标区域有 50bp。
PRIMER_SEQUENCING_SPACING=500 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 该值决定了在同一条链上的两个引物的距离.
PRIMER_SEQUENCING_INTERVAL=250 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 该值决定了在不同链上的两个引物的距离。
PRIMER_SEQUENCING_ACCURACY=20 # 该参数仅在 PRIMER_TASK=pick_sequencing_primers 时有效. 该值决定了引物设计的区间.
PRIMER_OUTSIDE_PENALTY=0
PRIMER_INSIDE_PENALTY=-1.0
PRIMER_WT_POS_PENALTY=0.0
### 非引物数据库设定：###
# 启用非引物数据库
#PRIMER_MISPRIMING_LIBRARY=
# 引物比对到非引物数据库
#PRIMER_MAX_LIBRARY_MISPRIMING=12.00
#PRIMER_WT_LIBRARY_MISPRIMING=0.0
#PRIMER_PAIR_MAX_LIBRARY_MISPRIMING=20.00
#PRIMER_PAIR_WT_LIBRARY_MISPRIMING=0.0
# 模板比对到非引物数据库
#PRIMER_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING=12.00
#PRIMER_WT_TEMPLATE_MISPRIMING=0.0
#PRIMER_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=40.00
#PRIMER_WT_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=0.0
#PRIMER_PAIR_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING=24.00
#PRIMER_PAIR_WT_TEMPLATE_MISPRIMING=0.0
#PRIMER_PAIR_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=70.00
#PRIMER_PAIR_WT_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=0.0
### PCR 反应体系设定: ###
PRIMER_SALT_MONOVALENT=50.0 # 单价盐离子浓度(mM)
PRIMER_SALT_CORRECTIONS=1 # PRIMER_SALT_CORRECTIONS=1 means use the salt correction in SantaLucia et al 1998
PRIMER_SALT_DIVALENT=1.5 # 二价镁离子浓度(mM)
PRIMER_DNTP_CONC=0.6 # 总dNTPs浓度(mM)
PRIMER_DNA_CONC=50.0 # DNA产物浓度(mM)
### PCR 产物的设定： ###
PRIMER_PRODUCT_MIN_TM=-1000000.0
PRIMER_PRODUCT_OPT_TM=0.0
PRIMER_PRODUCT_MAX_TM=1000000.0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_LT=0.0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_GT=0.0
PRIMER_PRODUCT_OPT_SIZE=0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_LT=0.0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_GT=0.0
## 罚分因子： ###
PRIMER_PAIR_WT_PR_PENALTY=1.0 # left primer和right primer的罚分之和。此和乘以此系数，再加其它罚分作为最终罚分。
PRIMER_PAIR_WT_IO_PENALTY=0.0 # 将 internal oligo 的罚分乘以此系数，加入到引物的最终罚分中。
### internal oligo 的设定：###
# TM 值
PRIMER_INTERNAL_MIN_TM=57.0
PRIMER_INTERNAL_OPT_TM=60.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_TM=63.0
PRIMER_INTERNAL_WT_TM_LT=1.0
PRIMER_INTERNAL_WT_TM_GT=1.0
# 长度
PRIMER_INTERNAL_MIN_SIZE=18
PRIMER_INTERNAL_OPT_SIZE=20
PRIMER_INTERNAL_MAX_SIZE=27
PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_LT=1.0
PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_GT=1.0
# GC 含量
PRIMER_INTERNAL_MIN_GC=20.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_GC=80.0
PRIMER_INTERNAL_OPT_GC_PERCENT=50.0
PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_LT=0.0
PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_GT=0.0
# 热力学
PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_ANY=12.00
PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_ANY=0.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_END=12.00
PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_END=0.0
# 碱基序列
PRIMER_INTERNAL_MAX_POLY_X=5
PRIMER_INTERNAL_MAX_NS_ACCEPTED=0
# 碱基质量
PRIMER_INTERNAL_MIN_QUALITY=0
PRIMER_INTERNAL_WT_END_QUAL=0.0
PRIMER_INTERNAL_WT_SEQ_QUAL=0.0
# 非引物数据库
#PRIMER_INTERNAL_MAX_LIBRARY_MISHYB=12.00
#PRIMER_INTERNAL_WT_LIBRARY_MISHYB=0.0
# PCR 反应体系
PRIMER_INTERNAL_SALT_MONOVALENT=50.0
PRIMER_INTERNAL_SALT_DIVALENT=1.5
PRIMER_INTERNAL_DNA_CONC=50.0
PRIMER_INTERNAL_DNTP_CONC=0.0
=
由于配置文件不能有空行和#
需要对p3_settings_from_chenlianfu.txt进行修改
perl -p -e 's/\s*#.*//; s/^\s*$//; s/P3_FILE_ID/\nP3_FILE_ID/' /opt/biosoft/Misa_Primer3/p3_settings_from_chenlianfu.txt > p3_settings_file
perl -p -i -e 's#^PRIMER_THERMODYNAMIC_PARAMETERS_PATH.*#PRIMER_THERMODYNAMIC_PARAMETERS_PATH=/opt/biosoft/primer3-2.6.1/src/primer3_config/#' p3_settings_file
[train@MiWiFi-R3P-srv SSR_detecting_and_primer_design]$ cat p3_settings_file
Primer3 File - http://primer3.sourceforge.net
P3_FILE_TYPE=settings
P3_FILE_ID=P3 Settings from Lianfu Chen
PRIMER_FIRST_BASE_INDEX=1
PRIMER_TASK=generic
PRIMER_NUM_RETURN=5
PRIMER_PICK_LEFT_PRIMER=1
PRIMER_PICK_INTERNAL_OLIGO=0
PRIMER_PICK_RIGHT_PRIMER=1
PRIMER_PICK_ANYWAY=1
PRIMER_THERMODYNAMIC_PARAMETERS_PATH=/opt/biosoft/primer3-2.6.1/src/primer3_config/
PRIMER_TM_FORMULA=1
PRIMER_MIN_TM=55.0
PRIMER_OPT_TM=60.0
PRIMER_MAX_TM=65.0
PRIMER_PAIR_MAX_DIFF_TM=5.0
PRIMER_WT_TM_LT=0
PRIMER_WT_TM_GT=0
PRIMER_PAIR_WT_DIFF_TM=0.0
PRIMER_MIN_SIZE=18
PRIMER_OPT_SIZE=20
PRIMER_MAX_SIZE=22
PRIMER_WT_SIZE_LT=0
PRIMER_WT_SIZE_GT=0
PRIMER_MIN_GC=30.0
PRIMER_MAX_GC=70.0
PRIMER_WT_GC_PERCENT_LT=0.0
PRIMER_WT_GC_PERCENT_GT=0.0
PRIMER_THERMODYNAMIC_OLIGO_ALIGNMENT=1
PRIMER_MAX_SELF_ANY=8.00
PRIMER_WT_SELF_ANY=0.0
PRIMER_MAX_SELF_ANY_TH=45.00
PRIMER_WT_SELF_ANY_TH=123.2
PRIMER_MAX_SELF_END=3.00
PRIMER_WT_SELF_END=0.0
PRIMER_MAX_SELF_END_TH=35.00
PRIMER_WT_SELF_END_TH=302.4
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY=8.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY=0.0
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY_TH=45.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY_TH=123.2
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END=3.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END=0.0
PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END_TH=35.00
PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END_TH=302.4
PRIMER_MAX_HAIRPIN_TH=24.00
PRIMER_WT_HAIRPIN_TH=672
PRIMER_MAX_END_STABILITY=9.0
PRIMER_WT_END_STABILITY=1
PRIMER_LOWERCASE_MASKING=0
PRIMER_MAX_POLY_X=4
PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED=0
PRIMER_WT_NUM_NS=0.0
PRIMER_MAX_END_GC=5
PRIMER_GC_CLAMP=0
PRIMER_LIBERAL_BASE=1
PRIMER_LIB_AMBIGUITY_CODES_CONSENSUS=0
PRIMER_MIN_QUALITY=0
PRIMER_MIN_END_QUALITY=0
PRIMER_QUALITY_RANGE_MIN=0
PRIMER_QUALITY_RANGE_MAX=100
PRIMER_WT_SEQ_QUAL=0.0
PRIMER_WT_END_QUAL=0.0
PRIMER_SEQUENCING_LEAD=50
PRIMER_SEQUENCING_SPACING=500
PRIMER_SEQUENCING_INTERVAL=250
PRIMER_SEQUENCING_ACCURACY=20
PRIMER_OUTSIDE_PENALTY=0
PRIMER_INSIDE_PENALTY=-1.0
PRIMER_WT_POS_PENALTY=0.0
PRIMER_SALT_MONOVALENT=50.0
PRIMER_SALT_CORRECTIONS=1
PRIMER_SALT_DIVALENT=1.5
PRIMER_DNTP_CONC=0.6
PRIMER_DNA_CONC=50.0
PRIMER_PRODUCT_MIN_TM=-1000000.0
PRIMER_PRODUCT_OPT_TM=0.0
PRIMER_PRODUCT_MAX_TM=1000000.0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_LT=0.0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_GT=0.0
PRIMER_PRODUCT_OPT_SIZE=0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_LT=0.0
PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_GT=0.0
PRIMER_PAIR_WT_PR_PENALTY=1.0
PRIMER_PAIR_WT_IO_PENALTY=0.0
PRIMER_INTERNAL_MIN_TM=57.0
PRIMER_INTERNAL_OPT_TM=60.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_TM=63.0
PRIMER_INTERNAL_WT_TM_LT=1.0
PRIMER_INTERNAL_WT_TM_GT=1.0
PRIMER_INTERNAL_MIN_SIZE=18
PRIMER_INTERNAL_OPT_SIZE=20
PRIMER_INTERNAL_MAX_SIZE=27
PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_LT=1.0
PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_GT=1.0
PRIMER_INTERNAL_MIN_GC=20.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_GC=80.0
PRIMER_INTERNAL_OPT_GC_PERCENT=50.0
PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_LT=0.0
PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_GT=0.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_ANY=12.00
PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_ANY=0.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_END=12.00
PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_END=0.0
PRIMER_INTERNAL_MAX_POLY_X=5
PRIMER_INTERNAL_MAX_NS_ACCEPTED=0
PRIMER_INTERNAL_MIN_QUALITY=0
PRIMER_INTERNAL_WT_END_QUAL=0.0
PRIMER_INTERNAL_WT_SEQ_QUAL=0.0
PRIMER_INTERNAL_SALT_MONOVALENT=50.0
PRIMER_INTERNAL_SALT_DIVALENT=1.5
PRIMER_INTERNAL_DNA_CONC=50.0
PRIMER_INTERNAL_DNTP_CONC=0.0
=
[train@MiWiFi-R3P-srv misa_primer3.tmp]$ misa_primer3.pl
Usage:
perl /opt/biosoft/Misa_Primer3/misa_primer3.pl genome.fasta.misa genome.fasta > SSR_primer3.out
--flanking_length <INT> Default: 300
设计引物时提取SSR两侧翼该长度的序列作为Primer3输入的模板序列。
--min_product_length <INT> Default: 100
引物得到的最小产物长度。
--max_product_length <INT> Default: 250
引物得到的最大产物长度。
--CPU <INT> Default:1
程序调用ParaFly命令进行并行化计算，该参数设置并行数。
--p3_setting_file <STRING>
程序使用Primer3进行引物批量设计，该参数设置所使用的Primer3配置文件。若不输入该参数，Primer3默认得到的结果会很差。
--gff3_out <STRING>
可以选择输出GFF3格式的结果。
misa_primer3.pl --CPU 8 --gff3_out misa_primer3.gff3 --p3_setting_file p3_settings_file genome.fasta.misa genome.fasta > misa_primer3.out
[train@MiWiFi-R3P-srv SSR_detecting_and_primer_design]$ ls
genome.fasta genome.fasta.statistics misa_primer3.commands misa_primer3.gff3 misa_primer3.tmp
genome.fasta.misa misa.ini misa_primer3.commands.completed misa_primer3.out p3_settings_file
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