大家好呀，今天为大家介绍的这篇文献于2021年5月25日发表于Clinical Cancer Research(IF: 10+)，题目为《Single cell characterization of the immune microenvironment of melanoma brain and leptomeningeal metastases》，在本文中对黑色素瘤CNS转移的两种不同表型：黑色素瘤脑转移(MBM)和软脑膜转移(LMM)的免疫微环境进行单细胞测序，发现在不同类型的患者中对治疗应答存在差异。
研究背景
黑色素瘤可以转移到许多器官，常见的部位是脑、皮肤、肺、肝和骨骼。在超过40-60%的转移性黑色素瘤患者中，CNS受累明显，尸检时发生率高达75%。在约5%的病例中，黑色素瘤细胞转移至软脑膜、蛛网膜下腔和脑脊液(CSF)。
软脑膜黑色素瘤转移(LMM)患者的预后最差，其特征为疾病快速进展（平均生存期8-10周）和神经系统原因导致的死亡。靶向治疗和免疫治疗改善了大多数晚期黑色素瘤患者的生存期。尽管如此，患者的缓解通常具有异质性，一些病变缓解良好，而其他病变缓解不佳。接受BRAF-MEK抑制剂治疗和免疫治疗的患者即使颅外疾病得到良好控制，也经常显示脑部进展。也有证据表明，黑色素瘤脑转移对靶向治疗和免疫治疗的缓解持续时间短于颅外部位。在LMM患者中，靶向治疗或免疫治疗后的结局特别差。
尽管MBM患者对靶向治疗和免疫治疗的反应均良好，但LMM患者的反应非常差，表明这两个CNS隔室的免疫微环境之间存在显著差异。尽管大多数LMM患者进展迅速，但一小部分个体在治疗中表现良好，并可在诊断后存活多年。为了更好地理解这些差异，作者对取自三个不同转移部位（皮肤、大脑和软脑膜/CSF）的26例个体的43例临床黑色素瘤标本进行了单细胞RNA-Seq(scRNA-Seq)分析。
研究方法
样本：来自24例患者的41份人黑色素瘤标本和来自2例非LMM患者的2份CSF样本。
QC与细胞分型：2,367 cells with >20% reads in mitochondria were filtered，使用R包SingleR作为细胞分型的支持包。
相关分析：Spearman相关性分析，Log-rank检验比较两组生存差异。
细胞配受体交互分析：SingleCellSignalR。
生存分析：Log-rank检验
结果
（一）：不同部位黑色素瘤转移的情况。为了在单细胞分辨率下探究肿瘤微环境(TME)，研究人员对43例患者标本进行了单细胞测序(图1)。所有皮肤和LMM样本均携带BRAF V600E突变。在脑转移样本中，8/14例携带BRAF V600E突变，1例BRAF D594N突变，1例BRAF V600K突变，1例BRAF K601E/GNAS R201P突变，1例NRAS Q61K突变和2例无任何可识别的驱动突变。
作者使用自己开发的分析工具ISCVA对单细胞数据进行分析，并对样本中恶性细胞和正常细胞进行可视化（图1A和B），并使用SingleR对细胞类型进行预测。共鉴定出10种广泛的细胞类型（黑色素瘤细胞、巨噬细胞/单核细胞/DC、T/NKs、pDC、成纤维细胞、B细胞、浆细胞、神经元、内皮和其他细胞）。对所有43个样本的分析显示，黑色素瘤细胞是最多样的细胞群，单个患者的细胞形成了不同的亚群，来自不同患者的基质细胞和免疫细胞亚型倾向于聚集在一起（图1B）。
每个部位的细胞类型分析也显示TME组成存在明显差异（图1C）。LMM样本中的细胞在T/NK细胞中更丰富，并且髓系/单核细胞比例最高。脑转移样本中每个样本黑色素瘤细胞比例最高，T/NK细胞数量较低，并且存在浆细胞、B细胞和神经元（以及其他神经元细胞）。皮肤转移瘤样本中经常含有成纤维细胞和数量最多的B细胞（图1C）。在单个样品水平下，观察到细胞组成存在相当大的变异性。
结果二：MBM和LMM微环境中的淋巴细胞组成
黑色素瘤对免疫治疗方法非常敏感。免疫浸润的性质和程度（也称为“热”或“冷”免疫微环境）被认为可预测免疫治疗的结局和反应。在三种转移环境中，每种环境的T细胞和NK细胞特征均存在差异（图2A）。值得注意的是，与CSF相比，脑转移瘤的淋巴细胞倾向于与皮肤的淋巴细胞重叠更多。淋巴细胞群的高水平概述表明三个转移部位之间的基因表达模式不同（图2B）。然后作者对不同细胞亚群又进行了进一步的分型，包括所有的T/NK细胞（图2C，D）。
从免疫细胞组成中发现，LMM样本中CD4 T细胞比例最高，CD8细胞数量最少。MBM标本的CD4和NK细胞比例最低，但CD8 T细胞比例更高（图2F）。进一步分析可以发现CD4 T细胞内的异质性最大，观察到明显的器官特异性（图2G）。LMM标本的特征是耗竭和凋亡CD4细胞数量最多。脑样本含有活化的CD4 T细胞，皮肤也显示最大比例的增殖CD4 T细胞富集（图2F，G）。总体而言，与脑和CSF相比，皮肤和脑之间的CD4 T细胞簇重叠更大（图2F，G）。
结果（三）：MBM和LMM免疫微环境的髓系组成
肿瘤中髓系细胞群的扩增，包括树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和髓源性抑制细胞(MDSCs)，是一个动态过程，可导致抗肿瘤或促致瘤作用。在髓系分析中共发现了32个亚群，并被定义为7个细胞亚型，包括pDC，cDC1，cDC2,DC3，巨噬细胞，moDC，MDSC等。
同时，研究人员再次注意到髓系细胞的组成多样性取决于转移部位。LMM和脑样本中MDSC样细胞比例较高，脑和皮肤转移灶中巨噬细胞百分比较高，LMM和皮肤中树突状细胞比例较高（图3H）。MBM标本在免疫抑制骨髓细胞群中较高，在可能的抗原呈递DC上较低。
结果（四）：LMM中治疗应答率高的患者的免疫微环境与无LMM患者更接近
在LMM患者队列中，有5例结局不佳的患者和1例存活超过38个月的患者，作者对其之间的差异进行研究，发现应答者的淋巴细胞谱更接近非肿瘤CSF对照，其特征是高比例的 CD4 T 细胞、CD8 Tem 细胞，并且DC细胞，B细胞和浆细胞的比例更高。在不同（反应不佳）个体（患者D）中，肿瘤负荷增加（样本15-16之间）与总免疫细胞数量减少和moMDSCs数量增加相关（图4E）。总之，这些结果表明，LMM良好应答者具有更有利的免疫环境，可在免疫检查点抑制剂治疗后形成，而应答不良的患者的特征为T细胞失活和具有更多巨噬细胞和MDSC。
结果（5）：全身靶向治疗和免疫治疗有助于塑造MBM的免疫环境。
接下来，研究人员描述了患者间变异性和治疗干预如何影响MBM的免疫环境（图5A-C）。在大多数情况下，全身靶向治疗或免疫治疗与浸润免疫细胞数量增加相关。靶向治疗与CD8 T细胞与CD4 T细胞比值增加相关，在治疗前标本或免疫治疗后不太常见。为了确定scRNA-Seq的准确，对8个开颅标本（样本保留）进行了流式细胞术检测，发现两种方法在多种细胞类型的数量上有很好的一致性。
结果（6）：DC3s作为黑色素瘤免疫微环境正调控因子
在树突状细胞中，cDC1、cDC2和DC3与黑色素瘤细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞数量减少相关。DC3s与CD4和CD8 T细胞的不同阵列表现出最强的相关性。值得注意的是，DC3细胞的存在与黑色素瘤细胞中MHC I类和II类分子的高表达相关。接下来对DC3s和多个T细胞亚群之间的配体-受体相互作用进行了计算机模拟分析，并确定了DC3s和活化的组织驻留记忆CD8 T细胞和CD4滤泡辅助细胞的两个亚类之间的强相互作用，表明DC3s可能驱动活性T细胞反应。生存分析显示，平均DC3比例越高，生存结局越好(HR = 0.009，p = 0.019)。
文献：Single cell characterization of the immune microenvironment of melanoma brain and leptomeningeal metastases
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