A MicroRNA Signature Identifies Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients at Risk for Lymph Node Metastases
MicroRNA签名识别胰管腺癌患者的淋巴结转移风险
发表期刊：GASTROENTEROLOGY
发表日期：2020 Aug
影响因子：17.373
DOI: 10.1053/j.gastro.2020.04.057.
一、研究背景
胰管腺癌(PDAC)是一种极其致命的恶性肿瘤，预计到2030年将成为美国癌症相关死亡的第二大原因。虽然局部肿瘤的完全手术切除是治愈或长期存活的唯一治疗方案，但80%-90%的患者在最初诊断时有不可切除或边缘可切除的疾病，导致生存结果不佳。因此，由于局部和远处复发的风险较高，PDAC患者手术切除后的5年生存率最多只有10%～25%。
对于PDAC的可切除癌患者，指南建议仅在有限的具有特定高危特征的患者子集中考虑NAT，这些特征包括大区域淋巴结（LNs）、碳水化合物抗原19-9（CA19-9）水平升高、原发肿瘤大、体重过度减轻和极度疼痛。在所有这些风险因素中，淋巴结转移（LNM）状态仍然是接受治疗性切除患者生存的最重要预测因素之一，它被认为对PDAC患者的风险分层和治疗决策具有巨大的临床意义。
二、材料与方法
1 数据来源
1）发现集（n=269）：TCGA数据集（167例患者，121例LNM阳性[LNP]和46例LNM阴性[LNN]）、GSE24279（77例患者，69例LNP和8例LNN）和GSE32688（25例患者，17例LNP和8例LNN）。下载患者的miRNA表达谱。
2）患者队列：2001年至2017年在奈良医科大学注册的PDAC患者的训练队列（n=157；83 LNP和74 LNN），以及2002年至2016年在日本熊本大学注册的患者的验证队列（n=107；63 LNP和44 LNN）。
2 分析流程
流程图
三、结果展示
01 - 发现用于检测胰腺导管腺癌患者淋巴结转移的新的7- MicroRNA特征
作者在3个独立的miRNA表达谱数据集（TCGA、GSE24279和GSE32688）中进行了全基因组、无偏倚、全面的生物标志物发现分析，以确定检测PDAC患者LNM的miRNA特征。
首先比较了TCGA和GSE24279队列中LNP和LNN患者之间的miRNA表达谱，这两个队列中包括了接受过治愈性手术而没有NAT的患者，发现了13个差异表达（P < 0.05）的候选靶点。
基于随机森林的递归特征消除，并对该数据集进行10倍的交叉验证，将其还原为10个miRNA的特征。其中，有7个miRNA在3个数据集中表现出一致的表达谱：miR-155-5p、miR-196b-5p、miR-365a-5p、miR-629-5p、miR-675-3p、miR-92b-3p和let-7d-5p。
最后，在TCGA队列中用这7种miRNA建立逻辑回归模型，结果AUC为0.76。此外，这7个miRNA签名的诊断能力在另外2个数据组中得到了显著验证 (图1A-C)，突出了该特征对PDAC患者LNM的识别诊断性能。
图1 在全基因组范围内发现并验证了一个检测PDAC患者LNM的新型miRNA标志
02 - 建立用于检测胰管腺癌患者淋巴结转移的MicroRNA特征
为了证实发现的miRNA签名的诊断鲁棒性，在2个大型、独立的临床队列中对这些生物标志物进行了训练和验证。首先，在157例PDAC患者（83例LNP和74例LNN）的训练队列中，通过PCR检测评估了7-miRNA签名的性能。
在训练队列中，排除了1个miRNA(let-7d-5p)，因为它在内部验证队列中表现出不一致的表达，导致最终的签名为6个miRNA(miR-155-5p、miR-196b-5p、miR-365a-5p、miR-629-5p、miR-675-3p和miR-92b-3p)。作者成功地从3个公共数据集中再次确认了该6-miRNA模型检测PDAC患者LNM的诊断准确性（图S2）。
图S2
在训练队列中使用逻辑回归分析训练了一个6-miRNA风险预测模型，该模型稳健地识别了PDAC患者的LNM（图2A和C）。
基于各个miRNA的系数和从该分析中得出的常数，建立风险评分模型如下：2.50737+（0.50693×miR-155-5p）+（0.082317×miR-196b-5p）+（0.014458×miR-365a-5p）+（1.74439×miR-629-5p）+（2.71643×miR-675-3p）+（-5.15058×miR-92b-3p）。
通过将相同的统计模型应用到一个大型的、独立的验证队列（63例LNP和44例LNN）中，评估了这个6-miRNA签名的稳健性和准确性。miRNA生物标志物在该验证队列中对PDAC患者LNM的识别也表现出了显著的诊断准确性（图2B和D）。
图2 在2个独立的临床队列中训练和验证识别PDAC患者LNM的miRNA签名
03 - 生物标志物和CA19-9的组合签名在检测胰腺导管腺癌患者淋巴结转移方面显示出更高的准确性
由于CA19-9是PDAC中广泛建立的重要生物标志物，作者接下来研究了我们的miRNA签名和该糖蛋白水平的组合模型是否可以进一步提高PDAC患者检测LNM的诊断准确性。发现这种新的组合签名在训练队列和验证队列中都显示出显著优越的LNM诊断准确性（图2E和F）。此外，与其他经典的术前临床病理特征（包括肿瘤位置和大小）相比，这种新的组合签名也显示出显著提高的诊断准确性（图2E和F）。
接下来，作者使用该6-miRNA签名模型中的Youden指数得出的截止阈值将所有患者分为高危组和低危组，随后进行单变量和多变量分析的logistic回归。多变量分析显示，我们新建立的签名作为PDAC患者LNM的独立预测因子出现。
04 - 临床队列中MicroRNA特征对胰腺导管腺癌患者的预后预测潜力
由于LNM通常与PDAC患者的不良生存期相关，接下来讨论miRNA签名的预后潜力。与之前的报告一致，LNM的存在对训练和验证队列中患者的预后有显著影响（图S3）。
图S3
为了评估miRNA生物标志物的预后潜力，进行了OS和RFS的生存分析。训练队列的中位随访时间为65.7个月，验证队列的中位随访时间为32.94个月。重要的是，高危组内的PDAC患者在训练队列和验证队列中的预后明显更差（图3A、B、D和E）。此外，在使用Cox比例危险模型以及其他临床病理因素的多变量分析中，由miRNA签名定义的高危患者与两个独立队列中显著恶化的OS相关（图3C和F）。这些结果显示，签名除了在PDAC患者中检测LNM的诊断能力外，它还具有显著的预后潜力。
图3 临床队列中PDAC患者miRNA特征的预后潜力
05 - 胰管腺癌患者内镜超声引导下细针穿刺活检标本中的MicroRNA特征的高阶验证
如果在活检标本中进行这样的验证是可行的，医生将能够做出更明智的决定，为被归类为高风险的患者提供NAT，这些患者被认为有其他可切除的疾病，并提高他们的生存率。
基于这一假设，从训练队列和验证队列的47名PDAC患者中收集了匹配的EUS-FNA活检标本。所有47名患者均根据NCCN可切除状态被归类为可切除疾病。作者评估了miRNA生物标志物在这些活检标本中的诊断准确性，能够成功地确认它产生的AUC值为0.78，用于区分LNM（图4A和B）。
与训练和验证队列一致，该模型的性能通过与CA19-9的组合得到改善，并显示出优于其他临床病理因素的诊断潜力（图4C）。此外，LNM检测的多变量logistic回归分析显示，6-miRNA签名在FNA活检队列中是一个排他性的显著检测标志物（图4D）。
图4 PDAC患者EUS-FNA活检标本中miRNA特征的高阶验证
06 - 内镜超声引导下细针穿刺活检标本中的MicroRNA特征在预测新辅助治疗后残余结节受累方面的性能验证
目前，包括NAT在内的多学科治疗策略在可切除和边缘切除PDAC患者中正在积极探索，并越来越普遍，尤其是在西方国家。此外，病理结节参与状态，这是修改NAT（ypN）的影响，NAT后的残余LNM状态，通常被认为是PDAC患者手术后接受NAT的最重要的预后因素之一。
作者推测，miRNA签名也可能能够识别ypN状态之前的任何治疗，这可以潜在地告知医生更合适的治疗选择基于术前LNM状态。因此，为了在临床环境中更容易地转化我们的miRNA签名，招募了62名接受NAT后进行手术的患者队列（9名ypN阳性，53名ypN阴性），从中可以获得治疗前的EUS-FNA标本。
将相同的统计风险模型应用于该预处理EUS-FNA队列，这再次成功证实了风险分层在识别LNM阳性患者方面的稳健性，其AUC值为0.78（图5A和B）。当评估风险评分和ypN状态的分布时，作者观察到，ypN阳性的患者的风险评分显著高于ypN阴性的患者（图5C）。此外，在逻辑回归模型的多变量分析中，miRNA签名作为治疗前ypN预测的独立特征出现（图5D）。
图5 进一步验证了miRNA签名在预测EUS-FNA活检标本新辅助治疗后残余结节受累方面的性能
四、结论
总之，利用全基因组的miRNA表达谱分析工作，发现并开发了一个新的miRNA签名，成功地在切除的组织标本和EUS-FNA活检标本中验证了PDAC患者LNM的识别。在未来的前瞻性研究验证之前，这项研究结果强调了该签名在更合适的患者选择和改善PDAC患者的个体化治疗策略的机构的潜在临床影响。
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