Comprehensive analysis to identify DLEU2L/TAOK1 axis as a prognostic biomarker in hepatocellular carcinoma
综合分析确定DLEU2L/TAOK1轴为肝癌预后生物标志物的方法
发表期刊：Mol Ther Nucleic Acids
发表日期：2021 Jan 1
影响因子：7.032
DOI: 10.1016/j.omtn.2020.12.016
一、研究背景
肝癌，主要是肝细胞癌（HCC），是世界上第六大常见的癌症类型，也是第四大致死原因。HCC的发病率和死亡率在许多国家仍在持续上升，已被普遍认为是一种预后不良、生存率降低的癌症。因此，探索有用的HCC预后生物标志物和/或治疗靶点，以改善我们在疾病诊断、预防和治疗方面的不足是非常必要的。
磷酸酶和天麻同源基因（PTEN）是人类癌症（包括HCC）中非常常见的突变的肿瘤抑制基因。现有证据已经阐明了PTEN的活性，它可以通过突变、表观遗传沉默、异常蛋白、转录抑制、定位和翻译后修饰来调节。同时，PTEN表达减少是HCC中的常见事件，与疾病阶段、肿瘤等级和大小以及肿瘤标志物表达增加有关
二、材料与方法
1 数据来源
1）TCGA中获取371个HCC样本（50个配对的HCC样本）的mRNA-seq数据和367个HCC样本（50个配对的HCC样本）的miRNA-seq数据，使用FPKM标准化。
2）GEO数据库获取GSE41804（包括20个HCC样本和20个相邻的非肿瘤样本）。
3）CCLE和HPA检索验证了PTEN和TAOK1在HCC细胞系和蛋白水平上的表达。通过cBioPortal for Cancer Genomics获得PTEN和TAOK1的突变状态。
2 生物信息学分析
流程图
三、结果展示
01 - PTEN过表达在HCC中的肿瘤抑制作用及预后价值
为了研究PTEN在HCC中可能的作用，根据人类蛋白图谱（HPA）数据库，作者发现PTEN在正常肝组织中过度表达，但在HCC组织中下调表达（图2A）。从HPA获得的免疫组织化学（IHC）染色也证明了PTEN表达的类似下调（图2B）。
由于PTEN在肿瘤标本中异常下表达，接着研究PTEN在HCC患者中表达的临床意义。根据Kaplan-Meier生存曲线，如图2C所示，PTEN的较低表达与HCC队列患者的总生存期（OS）较差明显相关。
此外，为了了解HCC中PTEN异常低表达的潜在机制，分析了PTEN的基因组和拷贝数。OncoPrint图显示了TCGA HCC数据集中PTEN基因的缺失情况（图2D）。
如图2E所示，超过三分之一的HCC样本都藏有PTEN缺失，而且，一致的是，藏有PTEN缺失的HCC样本表现出比表现出二倍体PTEN的样本更低的mRNA表达。此外，在HCC样本中发现PTEN拷贝数值和mRNA表达之间存在正相关关系（图2F）。
图2 PTEN在人肝细胞癌（HCC）中的抑瘤作用
02 - 识别差异表达基因
根据以上分析，与PTEN相关的ceRNA网络可以作为HCC患者潜在的预后模型。从PTENhigh和PTENlow表达组的HCC样本中共整理出860个DElncRNAs、54个DEmiRNAs和1871个DEmRNAs。此外，在HCC样本和正常肝组织样本之间共鉴定出3371个DElncRNAs、420个DEmiRNAs和8294个DEmRNAs(图3A-3C和S2A-S2C)，热图描述了PTENhigh和PTENlow表达的HCC样本以及HCC和正常样本中15个重要可变基因的表达情况(图3D-3F和S2D-S2F)。
图3 HCC样本中PTENhigh和PTENlow表达之间的火山图和DElncRNAs、DEmiRNAs和DEmRNAs热图
图S2 HCCsamples和相邻非肿瘤样本之间DElncRNAs、DEmiRNAs和DEmRNAs的火山图和热图
03 - lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络的构建
为了建立HCC中lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络，在PTENhigh和PTENlow表达组以及HCC和正常肝组织组进行了联合分析。
结果显示，在8294个DEmRNAs中，有373个被识别出来。利用Cytoscape软件共纳入5个lncRNAs、4个miRNAs和372个mRNAs，形成HCC相关的lncRNA-miRNAmRNA三重调控网络（图4A）。利用Cytoscape插件cytoHubba确定枢纽三重调控网络。结果显示，确定了3个lncRNAs、4个miRNAs和6个mRNA（图4B）。
为了进一步探索与三重调控网络相关的潜在功能，利用Metascape进行功能富集分析（包括GO和KEGG）。结果显示，参与该网络的DEmRNAs在 "蛋白激酶活性"、"细胞形态发生参与分化 "和 "GTP酶结合 "方面的功能特别丰富（图4C）。
图4 lnRNA-miRNA-mRNA三重调控网络的构建及功能富集分析
04 - ceRNA网络的构建与验证及具有HCC特异性预后价值模型的选择
如上所述，PTENhigh和PTENlow表达组的HCC样本的表达水平与癌症和癌旁组的表达水平相反。结果显示，1个下调的和2个未分化的lncRNA，1个上调的和3个下调的miRNAs，3个下调和3个未分化的mRNAs，在PTENhigh和PTENlow表达组的HCC样本中（图5A）。还发现了两个上调和一个下调的lncRNA，一个上调和三个下调miRNAs，以及5个上调和1个下调的mRNAs在HCC和相邻正常肝组织中（图5B）。
图5 TCGA HCC数据集中13种枢纽RNA表达模式的分布情况
然后，为了确定这些RNA是否与HCC预后相关，采用Kaplan-Meier分析和对数秩检验对HCC患者进行OS分析(图6)。
图6 中枢三层调控网络中RNA的整体生存分析
考虑到lncRNAs的细胞定位决定了其潜在的机制，通过进行lncLocator分析了三种DElncRNAs的亚细胞定位。如图7A所示，DLEU2L主要位于细胞质中，但另外两个lncRNAs主要分布在细胞质中。
这些数据表明，DLEU2L可能作为一个ceRNA，通过sponging miR-99a-5p/miR-100-5p来改善TAOK1的表达。因此，构建了一个DLEU2L-miR-100-5p/miR-99a-5p-TAOK1 ceRNA网络（图7B）。通过TarBase和TargetScan分别预测DLEU2L和TAOK1 3′UTRs中的靶位点与miR-99a-5p和miR-100-5p配对（图7C）。
此外，表达相关性分析表明，DLEU2L表达与TAOK1表达之间存在正相关关系（图7D）。因此，选择ceRNA网络中的DLEU2L/TAOK1轴作为潜在的预后模型。
图7 ceRNA网络的构建和相关分析
05 - DLEU2L/TAOK1轴在HCC患者中的临床意义
为了确定DLEU2L和TAOK1的表达水平是否受到临床特征的影响，作者探讨了DLEU2L表达和TAOK1表达与临床因素的相关性。DLEU2L和TAOK1的表达水平均与肿瘤直径和肿瘤结节转移（TNM）阶段呈正相关。
为了进一步分析临床特征的预后意义，进行了单变量和多变量Cox回归分析，以确定OS相关特征。在DLEU2L和TAOK1的单变量Cox回归分析模型中，TCGA队列中HCC患者的一些预后因素（TNM期、肿瘤直径、淋巴结转移和远处转移）与OS密切相关。DLEU2L和TAOK1的过表达水平均与较差的预后显著相关。在TAOK1的多变量Cox回归分析中，HCC患者的肿瘤直径、远处转移和TAOK1高表达仍与OS相关。因此，TAOK1可能成为HCC患者的独立预后因素。
06 - TAOK1异常高表达及甲基化
为了更好地了解DLEU2L/TAOK1轴在HCC中的作用，接下来作者详细分析了TAOK1。首先，根据在线工具CCLE，发现TAOK1在HCC细胞系中高表达（图S4A）。此外，还进行了TAOK1在HCC患者中的差异分析。GEO数据库中的GSE41804 HCC队列，进一步验证TAOK1的表达情况（图S4B）。结果显示，TAOK1在HCC组织中的表达量明显高于配对的非肿瘤性肝组织。
图S4 验证TAOK1的表达方式
为了进一步阐明TAOK1在HCC组织中的异常上调机制，作者还通过各种方法探讨了TAOK1表达水平与其甲基化状态的相关性。首先，对HCC的TAOK1high组和TAOK1low组三种DNA甲基转移酶进行差异表达分析，结果显示TAOK1high组的DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达量较TAOK1low组明显增加（图8A）。其次，UALCAN的分析显示，DNMT1在正常肝组织中的甲基化水平有高于HCC组织的趋势（图8B）。同样，与HCC组织相比，癌旁正常组织中TAOK1的甲基化程度明显高于HCC组织（图8C）。此外，还发现TAOK1的DNA序列中有两个甲基化位点与其表达水平呈负相关（图8D）。
图8 TAOK1的甲基化分析
07 - HCC中免疫浸润与TAOK1表达的相关性及相关功能富集
为了评估TAOK1表达和HCC中免疫浸润水平之间的潜在关系，作者使用TIMER进行了以下分析。首先，"SCNA "模块分析显示，几种免疫细胞浸润水平似乎与TAOK1基因拷贝数的改变有关，包括HCC中的B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞和树枝状细胞（DCs）（图9A）。然后，"基因 "模块分析显示，TAOK1的表达与肿瘤纯度没有明显的相关性，但它与HCC中CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平明显正相关（图9B）。最后，进一步评价了免疫浸润对HCC患者临床预后的影响。
图9 HCC中TAOK1表达与免疫浸润的相关性分析
结果显示，高水平的CD4+细胞、巨噬细胞和中性粒细胞与生存期小于24个月的HCC患者预后不良有关。这些结果表明，DLEU2L/TAOK1轴可能通过调节肿瘤浸润免疫细胞的水平影响HCC和临床预后。
为了进一步验证TAOK1与多种免疫浸润细胞之间的关系，作者还探讨了TAOK1与16种免疫细胞的免疫标志物集之间的关联。还研究了GEPIA数据库中TAOK1的表达与HCC中树突状细胞、Th细胞（Th1、Th2和Th17）和Tregs的上述标志物的关系。
还进一步研究TAOK1在HCC中可能的功能，利用GO和KEGG通路富集分析TAOK1在HCC中的前200个相关基因（图S7）。
图S7 TAOK1的功能分析
四、结论
综上所述，本研究建立了与HCC预后相关的ceRNA（DLEU2L-hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99a-5p-TAOK1）过表达网络，更好地了解lncRNA-miRNA-mRNA之间的相关性。此外，还发现基于ceRNA的DLEU2L/TAOK1轴可以成为参与HCC的一个新的重要预后因子，该预后模型对于探索HCC的发病机制是有帮助的。
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