影响因子：7.3
研究概述：肝癌在全球的发病率呈上升趋势，由于诊断晚、化疗耐药、频繁复发和转移等原因，肝细胞癌（HCC）患者的5年总生存率（OS）一直没有明显改善，因此，筛选和确定有效的HCC诊断和治疗策略问题亟待解决。此研究旨在检测HCC中与糖酵解/葡萄糖生成相关的HCC中的糖酵解/葡萄糖生成相关基因，并评估它们在进展和免疫治疗反应中的潜在作用。本研究分析的数据来自GSE14520、GSE76427、GSE174570、TCGA、PXDO06512和GSE149614数据集，代谢通路来自MSigDB数据库。进行富集分析后，鉴定出HCC与正常组织中的差异基因，获得差异表达的糖酵解/糖生成相关基因，并根据候选基因的表达情况进行了共识聚类。通过单变量Cox回归分析等评估候选基因并筛选预后基因。最后，通过RT-qPCR检测、流式细胞检测等实验检验了主要结果。
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研究流程如下：
研究结果：
代谢通路的预后意义
为了评估HCC的代谢途径，进行了GSEA。结果显示，在TCGA（图2A）、GSE14520（图2B）、GSE76427（图2C）和GSE174570（图2D）中，柠檬酸循环、TCA循环、脂肪酸代谢、甘油脂代谢和糖酵解/葡萄糖生成在HCC中均被激活。K-M曲线显示，糖酵解/葡萄糖生成得分高的患者比糖酵解/葡萄糖生成得分低的患者有更好的OS（图2E、F、G）。其他三种代谢途径的得分对HCC患者的OS没有明显影响。
差异表达的糖酵解/葡萄糖生成相关基因
对HCC和对照组的DEGs进行鉴定，以确定糖酵解/葡萄糖生成相关基因在HCC中的差异表达。TCGA中共有2493个DEGs（图3A），GSE14520中共有2958个DEGs（图3B），GSE76427中共有3927个DEGs（图3C），GSE174570中共有583个DEGs（图3D）。通过交叉分析发现，有13个糖酵解/葡萄糖生成相关基因在HCC中有差异表达，可作为候选基因（图3E）。GSE174570的候选基因在配对肿瘤组织和相邻非肿瘤组织中的表达显示，BPGM在HCC中的表达显著高于对照组，而HK3、ENO3、ALDH1B1、ALDH9A1、ADH6、ADH1A、ADH1B、PCK1、ALDOB、FBP1、ALDH2和PCK2在HCC中的表达显著低于对照组（图3F）。
共识聚类分析确定了两个聚类
根据13个候选基因的表达情况，对TCGA中的HCC患者进行了共识聚类分析。在k=2时，累积分布函数（CDF）曲线下面积的增幅最大，聚类效果最好（图4A-C）。因此，得到了两个聚类：C1组和C2组。图4D显示了13个候选基因在C1和C2组中的表达情况。C1组患者的OS明显差于C2组（图4E）。
共有914个差异表达基因是三个数据集的交集（图5A），随后作者基于此进行了WGCNA分析。对软阈值功率的网络拓扑分析表明，b=6是构建共表达网络的最佳值（图5B）。然后得到七个模块（图5C）。相关性分析表明，棕色模块与C2的正相关性最大，与C1的负相关性最大（图5D）。富集分析发现，棕色模块基因主要参与生物过程中的有机酸代谢过程、小分子代谢过程和羧酸代谢过程（图5E）。在KEGG通路中，代谢通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解以及色氨酸代谢主要被棕色模块基因富集（图5F）。
两个聚类中的免疫和免疫治疗
为了研究糖酵解/糖生成是否与免疫微环境相关，作者探讨了TCGA中C1和C2的基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分和肿瘤纯度。结果显示，C1的免疫评分和肿瘤纯度明显高于C2，而C1的糖酵解/糖生成低于C2（图6A）。使用CIBERSORT测定了每个样本中免疫细胞的丰度（图6B），巨噬细胞M2和CD4+记忆静息T细胞在HCC中的丰度最高。比较HCC和对照组的免疫细胞浸润情况（图6C）,比较C1和C2组的免疫细胞浸润情况（图6D）,CD4+记忆活化T细胞、Tfh、Tregs和巨噬细胞M0在HCC组和C1组的浸润率均较高。此外，预测接受检查点抑制剂的C1组和C2组患者的效果差异，发现C1组潜在应答者的比例高于C2组（图6E）。通过SubMap分析，比较了C1和C2组患者接受抗PD-1或抗CTLA-4免疫疗法的反应（图6F）。结果发现，C1组的HCC患者对抗PD-1和抗CTLA-4的反应可能更敏感。
基于候选基因的预后基因鉴定
通过单变量Cox回归分析，从TCGA（图7A）、GSE14520（图7B）和GSE141198（图7C）中对OS有显著影响的候选基因中鉴定出5个交叉的DEGs。作为预后基因的ADH1A、ADH1B、ADH6、ALDOB和FBP1对HCC患者的预后均有保护作用，针对HCC患者的OS构建的提名图显示了预测预后的良好准确性（图7D）。校正曲线显示提名图的校正效果良好（图7E）。相关性分析结果显示，预后基因与Treg或巨噬细胞呈负相关，预后基因与单核细胞呈正相关（图7F）。根据中位风险评分，研究人员在TCGA中得到了两个亚型（高风险组和低风险组）（图7G）。预后基因在高危组中均为低表达，而在低危组中均为高表达。12个月、36个月和60个月的中位风险评分的ROC曲线（图7H）。与低风险组相比，高风险组的HCC患者预后更差（图7I）。
对PXD006512的蛋白质组数据进行了分析。HCC和对照组之间有5714个DEPs（图8A）。与对照组相比，候选基因的蛋白水平在HCC中均表达较低（图8B）。单变量Cox调节分析证实，ADH1A、ADH1B、ADH6和ALDOB对HCC有保护作用（图8C）。还通过中位风险评分预后基因建立了风险预后模型，将HCC样本分为高风险组和低风险组（图8D）。与低风险组相比，高风险组预后基因的蛋白水平表达也较低。12个月、36个月和60个月的中位风险评分（图8E）。与低风险组相比，高风险组的HCC患者预后较差（图8F）。
单细胞水平的综合预后基因
作者通过UMAP在HCC单细胞数据集中鉴定出34个聚类（图9A），根据标记基因进一步确定了以下11种主要细胞类型：B细胞、CD8+T细胞、CD45-LYZ+细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞（NK）、NKT细胞和Treg（图9B、C）。NKT细胞和CD45-LYZ+细胞在HCC样本中表达较多，而NK在正常样本中表达较多（图9D）。ADH1A、ADH1B、ADH6和ALDOB主要在单核细胞中表达，FBP1主要在单核细胞和巨噬细胞中表达（图9E）。
预后基因和免疫细胞的验证
RT-qPCR结果显示，与对照组相比，HCC中ADH1B、ALDOB、ADH1A、ADH6和FBP1的mRNA水平下降（图10A）。预后基因在HCC蛋白水平的表达也呈下降趋势（图10B）。通过IHC染色，研究人员进一步证实HCC中预后基因的表达低于对照组（图10C）。
通过流式细胞术检测，HCC中单核细胞和Treg的比例有所增加（图10D）。然后，根据CyTOF数据对免疫细胞进行可视化分析（图11A）。根据不同免疫细胞表面标志物的表达模式（图S5），发现单核细胞和Treg细胞在正常细胞（图11B）和肿瘤细胞（图11C）中明显富集。根据细胞密度图，发现单核细胞和Treg细胞从正常到肿瘤都有所增加（图11D）。重要的是，多重免疫组化染色检测了单核细胞（CD14）和Treg（FOXP3）标志蛋白的表达。如图11E所示，肿瘤中单核细胞和Treg的丰度均高于对照组。
研究总结：
该研究在基因数据集中验证了13个差异表达的糖酵解/糖元生成相关基因，发现了两种不同分子亚型（C1和C2）。C1组的免疫评分和肿瘤纯度明显高于C2组，CD4+记忆性活化T细胞、Tfh、Tregs和巨噬细胞M0在HCC和C1组中浸润较高。研究发现了五个新的预后基因（ADH1A、ADH1B、ADH6、ALDOB 和 FBP1）与 HCC 患者的 OS 显著相关，它们主要在单核细胞和巨噬细胞中表达，在 RT-qPCR 和 Western 印迹分析中，这些预后基因在 HCC 患者中的表达均有所下降。流式细胞术证实了 HCC 患者免疫细胞的异常浸润水平。这些发现强调了考虑HCC的分子亚型和免疫微环境对制定个性化治疗策略和改善患者预后的重要性。
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