文章信息：

文献：Microbiological Diagnostic Performance of Metagenomic Next-generation Sequencing When Applied to Clinical Practice
杂志：Clinical Infectious Diseases
时间：2018年11月
单位：复旦大学中山医院（胡必杰团队）

摘要：

背景：元基因组下一代测序(mNGS)被认为有可能取代传统的微生物学方法，因为它的全面性。然而，应用该试验的临床经验相对有限。
方法：2017年4月至12月共收集标本511例，回顾性诊断分为感染性疾病347例[67.9%]、非感染性疾病119例[23.3%]、未知病例45例[8.8%]。比较mNGS和培养对病原菌的诊断效果。并评估抗生素暴露对检出率的影响。
结果：mNGS诊断传染病的敏感性和特异性分别为50.7%和85.7%，优于培养，尤其是结核分枝杆菌(优势比[OR]， 4 [95%置信区间{CI}， 1.7-10.8];P < .01)，病毒(仅限mNGS;厌氧菌(OR，∞[95% CI, 1.71 -∞];P < .01和真菌(OR, 4.0 [95% CI, 1.6-10.3];P < . 01)。重要的是，对于常规方法不确定的mNGS阳性病例，43例(61%)导致诊断修改，41例(58%)不包括经验性抗生素。情况下,病毒,广谱抗生素通常管理(14/27),10的27例怀疑是不合适的。有趣的是，mNGS的敏感性优于培养(52.5% vs 34.2%);P < .01)与抗生素接触，但不是没有。
结论：mNGS对病原菌鉴定具有较高的敏感性，且受先前抗生素接触的影响较小，因此成为一种有前景的传染病检测技术。

一、样品的选择、分类和比较流程图：

图解：从561个样本中，共选取511个样本进行进一步分析。根据对患者的回顾性诊断，将样本分为感染性疾病(ID)、非感染性疾病(NID)和未知病因。所有样本都进行了宏基因组下一代测序(mNGS)和培养技术的一致性分析，而ID和NID患者则用于评估测试的诊断性能。进一步分析了ID组mNGS的潜在临床效益。缩写:ID，传染病;元基因组下一代测序;NID、非传染性的疾病。

二、样品处理、核酸抽提

血液标本在室温下保存，其他标本在检测前保存在液氮中。取患者3-4 mL血，置于乙二胺四乙酸管中，常温保存3-5分钟，血浆分离前，取血8小时内，4℃，1600g离心10分钟。血浆样本被转移到新的无菌试管中。按照标准程序采集患者痰液或支气管肺泡灌洗液(BALF) 0.5 - 3ml样本。在室温下用0.1% DTT(二硫苏糖醇)将痰液液化30分钟，BALF可直接用于下次操作。其他类型的样品(包括组织匀浆)的处理方式与BALF类似。然后,1.5毫升微型离心机管0.5毫升的样品和1 g为0.5毫米的玻璃珠被附加到一个水平平台在旋涡混合器和激动大力后30分钟。在2800 - 3200 rpm风潮,0.3毫升的样本分为一个新的1.5毫升微型离心机管,使用TIANamp微DNA和DNA提取工具包(DP316, Tiangen生物技术)根据制造商的建议。

三、建库

DNA库建立了通过一个end-repair适配器的方法增加了一夜之间,使用和聚合酶链反应(PCR)扩增分析之前使用一个离子激流质子音序器(生活技术,卡尔斯巴德,加州)。DNA文库的质量通过安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技，Santa Clara，加利福尼亚州)与定量PCR相结合来评估测序前的适配器。通过乳化PCR在OneTouch系统中制备合格的DNA文库，然后在Ion Torrent Proton (Life Technologies, South San Francisco, California)测序平台上进行测序。

四、生信分析

通过去除低质量和较短(长度<35 bp)的reads，然后使用Burrows-Wheeler比对方法对映射到人类参考基因组(hg19)的人类宿主序列进行去除，得到高质量的测序数据。通过同时比对由病毒、细菌、真菌和寄生虫组成的4个微生物基因组数据库，去除低复杂度reads后剩下的数据被分类。分类参考数据库下载自国家中心生物技术信息(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)。RefSeq包含4189个病毒分类单元的全基因组序列,2328个细菌基因组或支架,199个与人类感染有关的真菌序基因组,和135个与人类疾病有关寄生虫基因组。

五、阳性mNGS结果的标准

1. 细菌(分枝杆菌除外)、病毒和寄生虫:根据Langelier的研究，mNGS识别出一种微生物(物种水平)，其覆盖率是其他任何微生物的10倍。
2. 真菌:mNGS鉴定了一种微生物(物种水平)，由于其DNA提取中生物量较低，其覆盖率得分比任何其他真菌高出5倍。
3. 分枝杆菌:当至少1个read被映射到种或属水平时，结核分枝杆菌(MTB)被认为是阳性的，这是由于DNA提取的困难和低污染的可能性。由于医院-实验室环境污染和低产率的平衡，当标度读数(属或种水平)在细菌表前10位时，定义为阳性非结核分枝杆菌(NTM)。

补充表1-7为阳性样本(经培养证实)示例。从测序平台获得了多种参数，包括映射读数(种和属水平)、丰度(种和属水平)和覆盖率。考虑到核酸污染、测序reads总数、病原体基因组[2]大小等混杂因素，本研究以覆盖率作为测量参数(不包括分枝杆菌)。

六、统计方法

在适当的情况下，对离散变量采用Pearson检验、Fisher精确检验或McNemar检验进行比较分析。采用SPSS 22.0软件进行数据分析。< P值。05为显著性，所有检验均为双尾检验。