1、mNGS流程及步骤重点
在临床实验室实施mNGS是一项复杂的工作，需要使用符合法规标准的质量管理方法进行操作。mNGS流程分为实验操作（湿实验）和生信分析（干实验）两个部分。湿实验从收到标本(如痰液、肺泡灌洗液、血浆、脑脊液等）开始，针对不同的样本类型进行特异处理，提取核酸进行文库构建，然后上机测序；干实验包括下机数据的分析，去人源宿主序列，比对病原微生物数据库，进行种属鉴定，最后解读报告。在实施各个步骤时，都需要重点考虑一些因素，以下是mNGS流程图及各个步骤要点。
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2、mNGS关键挑战之---背景干扰
mNGS的一个关键限制是高背景下敏感性降低，主要来自人类宿主(如活体组织)或微生物组(如粪便)。目前通常的解决方法是增加测序量、在实验中对微生物的DNA和RNA进行富集及对宿主的核酸进行衰减、在下游生信流程通过数据库去除宿主序列。
（1）病原微生物RNA文库富集方法：
实验已经开发出了基于RNA文库的宿主衰减的有效方法，包括提取之后使用DNase I酶去除残留的人类背景DNA；使用RNA探针之后用RNase H酶进行处理；使用抗体处理人类或者线粒体中的rRNA（临床样品中含量最丰富的宿主RNA形式）；利用基于Cas9的方法，杂交衰减人类序列。
（2）病原微生物DNA文库富集方法：
由于大多数病原体基因组缺乏甲基化DNA, 可以用此方法富集微生物reads。使用针对甲基化的人类宿主DNA的抗体可以达到3 ~ 5倍范围的有限富集。DNase I酶降解背景DNA后会对人类细胞进行不同程度的裂解，从而保留和富集具有细胞壁的有机体的核酸，其中包括一些细菌和真菌，这种方法已被证明提供高达1000倍的大量微生物富集。然而，这种方法可能降低对无细胞壁微生物的敏感性，如支原体或寄生虫;使用额外试剂可能导致外源性本底污染的矛盾增加;
3、mNGS关键挑战之---缺乏标准品
为保证mNGS的检测质量和稳定性，需要具有良好特征的参考标准和控制。临床宏基因组分析目前缺乏标准品来验证方法的灵敏度、特异性、准确性和金标准方法来证明实验的有效性、重现性和质量控制。
大多数可用的宏基因组标准参考品都是针对特定应用场景高度定制(例如，zymoBIOMICS微生物群落标准品是针对细菌和真菌群落)或聚焦于有限的特殊微生物群落(例如，美国国家标准与技术研究所(NIST)混合微生物DNA检测标准材料，仅含细菌)。这些材料并不适用于非靶向mNGS分析。
由微生物池(模拟微生物群落)或微生物核酸混合物可以作为外部控制来建立mNGS测试的检测限度。然而，由于缺乏普遍接受的mNGS参考标准，难以在不同实验室间比较mNGS的测定性能。迫切需要标准化的参照生物和基因组材料，以促进这种比较和确定最佳的分析方法。
4、mNGS关键挑战之---质量控制
质量控制是最重要的，必须开发方法，以确保整个分析工作流程分析的准确性。重要的质量控制步骤包括初始样本质量检查、污染核查、内部控制和外部控制。在试验开发和实施过程中产生的验证数据应记录下来，并提供给实验室检验员(用于实验室开发的试验)，或提交给监管机构，如美国FDA或欧洲药品管理局(EMA)，以获得批准。
持续的监测对于mNGS检测尤其重要，以验证长期的可接受性能和调查不典型的发现。通过样品内部控制、运行中控制样品、污染测试和定期熟练度测试来完成监控。
5、mNGS关键挑战之---生物信息学分析
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一个典型的mNGS生物信息学流程包括一系列从原始输入FASTQ文件的分析步骤，包括低质量和低复杂度的过滤、接头去除、去除人类宿主序列、通过参考数据库比对微生物识别、序列组装及根据reads或者组装出的连续序列(contigs)进行各个水平的分类，如科，属和种。流程中的每一步都必须仔细评估数据处理的准确性和完整性，并考虑到错误的传播。
此外，微生物参考基因组的公共数据库正在不断更新，实验室除了处理潜在的误注和其他数据库错误外，还需要跟踪使用的准确版本。结合来自多个数据库的注释序列的组合方法可以使微生物鉴定的敏感性和特异性更具可信性。
生物信息学分析的性能验证是一项耗时的工作，包括对照和患者数据集的分析和比较，以及正交临床试验来确定最终结果的准确性。通过ROC曲线建立阈值可以从背景中分离出真阳，这些阈值可以包括各种指标，如与比对到检测微生物上的reads数、覆盖的非重叠基因组区域的数量等。
参考文献：
[1] Chiu C Y , Miller S A . Clinical metagenomics[J]. Nature Reviews Genetics, 2019.
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