The combined signatures of hypoxia and cellular landscape provides a prognostic and therapeutic biomarker in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma
缺氧和细胞景观的组合特征为乙型肝炎病毒相关肝细胞癌提供了预后和治疗性生物标志物
发表期刊：Int J Cancer
发表日期：2022 Apr 25
doi:10.1002/ijc.34045
一、背景
肝细胞癌（HCC）是世界上第四大癌症死亡原因，也占所有原发性肝脏恶性肿瘤的85%以上。尽管有国家疫苗计划和抗病毒疗法，乙肝病毒（HBV）感染估计影响全球2.92亿人，仍然是HCC的最大原因之一HBV在重塑肝脏肿瘤微环境（TME）方面起着关键作用，包括免疫和非免疫细胞群。鉴于TME内各种细胞的存在被证明对抗肿瘤免疫反应至关重要。许多非免疫细胞如TME中的基质细胞也与癌细胞相互作用，直接或间接地促进或抑制肿瘤的生长和扩散。
缺氧作为HCC中血管生成、转移和代谢改变的不利决定因素，低氧诱导因子1（HIF-1）的过度表达与预后不良密切相关。除了对肿瘤细胞的影响外，缺氧确实使TME中的一些事件发生，并影响到许多TME周围的细胞，这些细胞在肿瘤发生过程中起着至关重要的作用，从而促进了肿瘤的侵袭性和对抗肿瘤反应的抑制。
二、材料与方法
1.数据来源
临床信息完整且HBV感染阳性的患者（n = 596）被纳入本研究
(1)包括四个队列的452个HBV-HCC肿瘤（GSE14520、GSE10143、ICGC-LIRI-JP和Gao等人）和另一个来自TCGA-LIHC的144个HBV-HCC肿瘤作为独立的验证队列
(2)从GSE125449收集了9个HCC肿瘤的单细胞转录组数据和细胞注释
(3)3个HCV-HCC队列，以及32个泛癌队列
(4)从GEO数据库中招募了一组67例接受索拉非尼治疗的HCC患者（GSE109211）和一组65例接受MAGE-A3免疫治疗的黑色素瘤患者（GSE35640）
2.实验流程
(1)缺氧相关基因和TME细胞定量：KEGG数据库（途径“hsa04066”）获得了构成HIF-1信号通路的109个缺氧相关基因，从上述所有队列中提取所有缺氧相关基因的表达。利用xCell计算的富集评分来表示所有队列的每个肿瘤样本中每种TME细胞类型的丰度。
(2)预后缺氧相关基因和TME细胞的鉴定：缺氧相关基因和TME细胞的预后评估是通过四个不同队列中每个队列的Cox比例风险回归分析确定。
流程图
三、实验结果
01 - 对四个不同HBV-HCC队列的荟萃分析揭示了缺氧和TME的预后价值
作者共招募了596个HBV-HCC肿瘤，包括四个队列（GSE14520, ICGC-LIRI-JP, GSE10143, Gao et al, n = 452）和一个独立的验证队列（TCGA-CIHC, n = 144）。对于所有患者，在四个不同的队列中分别独立分析了109个缺氧相关基因和64个TME细胞类型的预后价值，然后使用荟萃分析来整合每个缺氧相关基因和TME细胞的总体预后评估。最终，基于452份HBV-HCC肿瘤样本，将48个缺氧相关基因和19个TME细胞鉴定为独立预后因子。这些预后基因/TME细胞及其相应的亚群（根据其基因功能或细胞类型进行分组）显示在一个网络中（图S1）。其中，大多数选定的缺氧相关基因在预后不利。值得注意的是，所有功能与减少耗氧量有关的基因都是不利因素，例如包括HK2、LDHA、PGK1、ALDOA等（图S1）。对于选定的TME细胞，12/19是预后有利的细胞，包括CD8+效应记忆T细胞、B细胞、浆细胞、NK细胞等。其余7个预后不利的细胞包括γδT细胞（Tgd）、嗜碱细胞、肥大细胞等（图S1）。
图S1 部分预后良好的TME细胞和缺氧相关基因及其相应的细胞类型和基因功能
随后分别根据预后缺氧和TME特征，将缺氧和TME特征考虑在内，制定了缺氧评分和TME评分。根据每个队列中缺氧评分和TME评分的平均值，将肿瘤分为两个亚组。值得注意的是，缺氧评分与预后不利的缺氧相关基因紧密正相关，与预后有利的基因负相关（图2A）。而对于TME评分，观察到TME评分与预后有利的TME细胞之间有强烈的正相关，与预后不利的TME细胞之间有负相关（图2B）。此外，与低氧评分和低TME评分的患者相比，低氧评分和高TME评分的患者在统计学上的生存期更长（图2C，D）。而缺氧评分高的肿瘤，其HIF-1通路的基因明显富集（图2E）。同样，TME得分高的肿瘤在免疫反应途径上也有富集（图2F）。为了进一步验证肝癌单细胞转录组图谱中的缺氧和TME分数，作者对9名患者的肝癌生物样本的单细胞数据进行了t分布的随机邻接嵌入（t-SNE）分析（图2G），并分别计算出缺氧和TME分数。据观察，恶性细胞和基质细胞表现出比免疫细胞更高的缺氧分数（图2H，J）。而免疫细胞如单核细胞/巨噬细胞、CD8 T细胞和浆细胞的TME得分高于任何其他基质成纤维细胞、恶性细胞或内皮细胞（图2I,K）。
图2 分别根据缺氧相关基因和TME细胞制定缺氧评分和TME评分
02 - 已建立的缺氧-TME分类器的预后价值
基于上述结果，作者考虑是否有可能将缺氧评分和TME评分结合起来，来描述缺氧性TME的特征。由于不仅在大多数HBV-HCC队列中发现缺氧评分和TME评分之间存在统计学意义上的负相关，而且在所有32个泛癌队列中也发现了这种负相关。因此，将缺氧评分与TME评分相结合，建立了缺氧-TME分类器，从而将患者分为四个亚组：缺氧低/TME高，缺氧低/TME低，缺氧高/TME高，缺氧高/TME低。低氧-TME分类器在HBV-HCC队列（n = 452）中显示了统计学上的不同预后（图3A）。研究发现，缺氧评分和TME评分都对预后价值有很大贡献。与其他三个亚组的患者相比，低氧/TME高亚组的患者具有最好的预后。缺氧低/TME低和缺氧高/TME高亚组患者的预后差异较小，在两个最大的队列中，缺氧低/TME低和缺氧高/TME高亚组不同疾病阶段的比例非常相似。因此，将这两个亚组合并为一个混合组。重要的是，缺氧-TME分类器的性能在另一个独立的HBV-HCC队列（n = 144）（图3B）、HCV-HCC队列（n = 270）和各种HCC患者（n = 1294）中得到进一步验证。此外分别基于三个亚组的缺氧-TME因子（缺氧相关基因和TME细胞）的综合内部和组间相关性生成了相关系数热图。在缺氧低/TME高和缺氧高/TME低亚组中出现了内部正相关和组间负相关的特点（图3C）。
图3 基于缺氧-TME分类器的预后价值和肿瘤细胞信号通路分析
为了描述缺氧-TME分类器的详细预后价值，对所有5个HBV-HCC队列和3个HCV-HCC队列分别进行了单变量和多变量Cox回归分析。在有足够患者的训练队列和一个验证HBV-HCC队列中，缺氧-TME分类器与总生存期显著相关（图3D）。另外，该分类器在三个HCV-HCC队列中的一个队列中显示了统计学意义上的预后价值（图3E）。同样，缺氧-TME分类器的预后价值可以在10/32个泛癌队列中得到验证。
03 - 不同缺氧-TME亚组之间的细胞信号通路的差异
考虑到基于缺氧-TME分类器的明显预后差异，在有足够基因进行通路分析的三个队列中，根据缺氧-TME亚组进行了肿瘤内细胞信号通路分析（图3F）。亚组中的肿瘤在肿瘤增殖和癌症代谢相关基因表达方面表现出不同的模式。与缺氧分数高的肿瘤相比，缺氧分数高的亚组中的肿瘤显示出氨基酸代谢、脂肪酸代谢、碳代谢和ATP结合盒（ABC）转运体相关基因表达的富集程度要高得多。此外，低TME评分亚组的肿瘤显示出比高TME评分的肿瘤更高的DNA复制、错配修复、细胞周期和RNA转运相关基因表达的丰富度。以上进一步证明了缺氧和TME对肿瘤代谢和癌细胞增殖的协同影响，这意味着对缺氧-TME进行综合分析的意义。
此外，作者还构建了蛋白图，以更好地显示缺氧低/TME高和缺氧高/TME低亚组之间的细胞信号通路差异。缺氧低/TME高组的肿瘤显示出补体级联和PPAR相关蛋白的较高富集度，这些蛋白在增强宿主免疫反应中发挥着重要作用。而缺氧高/TME低亚组的肿瘤显示出较高的细胞周期、DNA复制和转录因子的富集（图S9）。上述结果进一步说明了肿瘤微环境中缺氧评分（缺氧状态）和TME评分（免疫反应）的生理意义，这可能有助于阐明基于肿瘤生物学的不同亚组的预后差异。
图S9 功能分析
04 缺氧-TME分类器与临床特征和其他HCC相关分子分类特征之间的联系
作者接下来研究了基于缺氧-TME分类器的临床特征和其他HCC相关特征。与其他亚组相比，在缺氧高/TME低亚组中发现晚期HCC患者和肿瘤较大的患者略多。然而，AFP、多结节和肝硬化在不同的缺氧-TME亚组中并无差异（图4A，上栏）。为了进一步将缺氧-TME分类器与之前记载的其他HCC相关的分子分类签名进行比较，尽可能全面地分析了之前的HCC相关分子分类签名。热图显示，在预测HCC的预后方面，缺氧-TME分类器与来自24个不同研究的57个基因组签名非常一致（图4A）。缺氧低/TME高亚组的患者显示出不利于预后的相关特征的低富集，而这些特征在缺氧高/TME低亚组的患者中高度富集。同样，在缺氧低/TME高亚组中有利的预后特征大大丰富，而在缺氧低高TME低亚组中表达较少。混合亚组也显示了这些特征的混合模式。此外，缺氧-TME分类器可以明显区分HBV-HCC患者的总生存期（图4B）。图4C显示，缺氧-TME分类器可以预测1、2、3和5年的总生存期，AUCs范围为0.68至0.73。通过与目前的临床分期系统在总生存率的时间依赖性ROC下的比较，缺氧-TME分类器显示出比BCLC分期分类更高的功效，与TNM分期系统的性能相似（图4D）。值得注意的是，缺氧-TME分类器允许对早期HCC阶段（TNM I-II）和晚期HCC阶段（TNM III-IV）的患者进行进一步细分。缺氧低/TME高晚期 HCC 亚组患者的生存率与 缺氧高/TME低 晚期亚组患者的生存率有显着差异，但与 缺氧高/TME低早期 HCC 亚组患者的生存率相似（图4E）。因此，缺氧-TME分类器与TNM分类相结合，似乎比单独的TNM分类器提供更准确的预测价值。
图4 缺氧-TME分类器与其他HCC相关分子特征之间的联系
05 缺氧-TME亚组中肿瘤的差异
作者从几个方面进一步研究了不同亚组之间的免疫应答相关基因：主要组织相容性复合体（MHC）、抑制性免疫标志物、激活性免疫标志物、抗炎标志物、pH调节标志物等几个方面（图5）。与中间混合亚组和缺氧高TME低亚组相比，缺氧高TME高亚组的所有MHC、大部分抑制性免疫标志物（TIM-1除外）和所有激活性免疫标志物的表达量普遍较高。此外，缺氧低-TME高亚组显示TGFB1（抗炎基因）的表达低于其他两个亚组。而缺氧高TME低亚组被观察到有明显较高的CA9表达，该基因负责pH调节。关于免疫相关基因的更详细的结果也在热图中描述（图S10）。
图5 基于缺氧-TME分类器的三个亚组的免疫相关标志物的比较
图S10 不同缺氧-TME亚组下肿瘤中免疫相关基因的比较
06 - 缺氧-TME亚组患者肿瘤体细胞突变的差异模式
接下来，作者研究了不同缺氧-TME亚组的肿瘤体细胞改变。确定了TCGA-LIHC队列中前20个变异突变（图6A）。与缺氧低/TME高亚组相比，有12个突变在缺氧水平高/TME低亚组中显示出更高水平。特别是TP53突变在缺氧高/TME低亚组中明显较高。同样，在低氧/TME高亚组中TP53的平均表达量较低，没有TP53突变的患者生存率提高，这与以前的研究一致（图6C,D）。值得注意的是，在TP53突变患者的亚组中，缺氧-TME分类器可以识别预后更好的患者（图6E）。此外，由于肿瘤突变负荷是一种新兴的免疫治疗敏感性测量方法，我们还计算了每种肿瘤的TMB评分。缺氧TME亚组间未发现显著差异（图6B）。这些结果可能表明，缺氧-TME分类器在区分患者方面比TMB评分更敏感，并且可以更精细地识别P53突变患者更好的预后。
图6 肿瘤体细胞突变与缺氧-TME分类器之间的关系
07 - 基于缺氧-TME分类器对治疗反应的预测
接下来作者测试了缺氧-TME分类器是否可以用来预测接受治疗的患者的临床反应。在索拉非尼和MAGE-A3免疫疗法之前，分别收集了肿瘤样本的测序数据。然后评估了缺氧-TME分类器在接受多酪氨酸激酶抑制剂（mTKI）索拉非尼治疗的患者中治疗反应的预测能力，索拉非尼表现出抗增殖和抗血管生成的活性。拉非尼应答组的患者缺氧评分显著降低，TME评分较高（图7A，B）。与缺氧高/TME低患者相比，缺氧低/TME高患者的索拉非尼应答者比例要高得多（59.3%），而混合组和缺氧高/TME低亚组的索拉非尼应答者分别只有13.6%和11.1%（图 7C）。同样，对MAGE-A3免疫疗法有反应的转移性黑色素瘤患者在统计学上分别显示出较低的缺氧评分和较高的TME评分（图7D,E）。在缺氧低/TME高亚组中，有治疗反应的患者比例最高，而缺氧高/TME低亚组只有14.29%。此外，Proteomap被用来直观地展示缺氧-TME分类器预测接受MAGE-A3免疫疗法的患者的治疗反应的潜在机制。有趣的是，Proteomap在缺氧低/TME高和MAGE-A3反应者中的模式相当相似。此外，还观察到缺氧高/TME低亚组与MAGE-A3无应答者之间的高度相似性（图7G，H）。综上所述，这些结果可能表明，治疗前的缺氧TME特征可以描述肿瘤免疫微环境，从而有利于预测患者的治疗反应。
图7 基于缺氧-TME分类器的治疗反应预测
四、结论
本文基于对HBV相关肝癌中TME细胞状态和缺氧相关基因的综合分析，开发了缺氧-TME分类器。分类器的预后预测在各种HCC队列中得到证实。最佳预后和治疗反应与低缺氧/高TME评分有关。这些发现强调了基于缺氧和TME细胞特征评估肿瘤特异性生物学的重要性，为HCC的预后和治疗评估提供了新的机会。
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