Proteomics reveals NNMT as a master metabolic regulator of cancer associated fibroblasts

蛋白质组学揭示NNMT是癌症相关成纤维细胞的主要代谢调节剂

期刊：Nature；影响因子：42.77

发表单位：芝加哥大学等 

导 读

    高度浆液性癌是卵巢癌的最常见形式，也是最致命的形式。绝大多数的研究都聚焦于肿瘤本身，而忽略了肿瘤周围组织环境。来自芝加哥大学医学院的研究人员于2019年5月发表在《Nature》杂志上的一项研究中指出，基质对癌细胞有重大影响。在这种情况下，这使它们更具恶性，更具侵略性和侵入性。

    研究人员对肿瘤及其周围组织（特别是组织中的正常细胞，称为成纤维细胞）的系统检查发现了一种代谢酶烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT），该酶在转移癌细胞周围的基质中高度表达。NNMT是维持成纤维细胞表型的关键调控分子，NNMT会导致肿瘤基质中广泛的基因表达变化，从而将正常的成纤维细胞转变为支持并加速肿瘤生长的癌症相关成纤维细胞。基质NNMT表达促进卵巢癌的进展和转移，并与患者较差预后有关。抑制NNMT活性可以降低甚至逆转许多与癌症相关的成纤维细胞的促肿瘤作用，这表明应将基质作为新的治疗靶点进行研究。

    该研究首次在整个疾病发展过程中，将癌细胞中的分子变化与相邻基质中发生的分子变化区分开来，并指出转移性基质的特征是与癌细胞相比具有高度保守的蛋白质特征。

摘 要

    高度浆液性肿瘤（HGSC）的预后较差，主要是由于其在整个腹腔中的早期扩散。基因组学和蛋白质组学方法为卵巢癌（OvCa）的蛋白质基因组学提供了快照，但肿瘤和间质两个室的系统的检查对于理解OvCa转移是至关重要的。本研究开发了一种无标签的蛋白质组学工作流程来分析从每个隔室中分离出细胞。肿瘤蛋白组在从原位病变到转移性疾病的进展过程中是稳定的，然而转移相关间质具有高度保守的蛋白组特征，主要包括甲基转移酶烟酰胺n -甲基转移酶（NNMT）及其调控的几种蛋白。间质NNMT表达对于癌症相关成纤维细胞（CAF）表型的功能方面，包括CAF标记的表达、细胞因子和致癌细胞外基质的分泌是必要的。间质NNMT表达支持OvCa迁移、增殖以及体内生长和转移。CAF中NNMT的表达导致S-腺苷甲硫氨酸（SAM）耗竭，组蛋白甲基化的减少与肿瘤基质中广泛的基因表达变化有关。这项工作支持使用超低输入蛋白质组学来识别疾病表型的候选驱动因素。NNMT是CAF分化和基质中癌症进展的主要代谢调节因子，可能是治疗性靶标。

前 言

    浆液性肿瘤的特征通常在于拷贝数变异。高度浆液性肿瘤（HGSC）的间质比例很高，但关于癌细胞与周围细胞外微环境之间的相互作用如何影响肿瘤生长的知之甚少。若干报告描述人类卵巢癌（OvCa）的蛋白质组，但没有一个在基质蛋白和上皮性肿瘤室之间区分。考虑到基质在发展和转移过程中具有肿瘤支持作用并与上皮区共同演变，本研究以系统的方式评估肿瘤及其周围基质的蛋白质组，以更深入地理解卵巢癌转移机制。

研究概要

1    卵巢癌的蛋白组学特征

    为了阐明肿瘤和基质中OvCa进展的蛋白质组学变化，研究确定了来自11名HGSC患者的107个肿瘤组织与肿瘤周边基质。肿瘤组织包括浆液性输卵管原位癌（STIC）、浸润性输卵管（FT）病变、浸润性卵巢病变和网膜（Om）转移。蛋白质组分析共定量了6944种蛋白质，无监督聚类稳健地区分肿瘤和基质蛋白质组。肿瘤区室富含HGSC（PAX8、MSLN、MUC16、EPCAM）和DNA复制和修复途径的已知标记物，而基质区室的特征在于ECM成分的表达和包括活化成纤维细胞标记物的途径（例如胶原蛋白、波形蛋白、蛋白聚糖、肌腱蛋白和肌球蛋白）。各肿瘤亚型和基质的差异蛋白中，许多是已报道的参与网膜转移的蛋白。基质标记包括已知在基质中具有肿瘤支持作用的蛋白质，例如FAP、LOX、TNC和VCAN，并且与间充质TCGA亚型有相当大的重叠。由于其生化活性及其在表观遗传调控中的作用，上调的网膜基质中烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）被作者关注。

图1，卵巢癌蛋白质组学揭示了HGSC转移的基质特征。（a）肿瘤的组织学特征及蛋白质谱分析；（b）每个解剖区室中量化的独特蛋白质数量；（c）肿瘤相对于基质中表达蛋白质的排名，突出显示已知的标记；（d）肿瘤和基质中显著差异表达的蛋白质；（e）所有患者和解剖部位中上调的网膜基质转移特征蛋白质的热图。

2    NNMT在肿瘤转移基质中高表达且调控CAF表型

    NNMT是参与表观遗传调控的因子，为了验证NNMT是否促进肿瘤进展，作者从多个角度进行验证。蛋白质组学分析显示，与良性网膜、输卵管和卵巢基质（包括早期微转移）相比，腹膜和网膜转移基质中NNMT表达增加，这在包含原发性和转移性OvCa样品的组织芯片中也得到了证实（组学表达谱验证NNMT在肿瘤中高表达）。NNMT表达是多种癌症类型中成纤维细胞（CAF）的特征。CAF中的NNMT的敲低导致细胞形态恢复为与正常网膜成纤维细胞更相似的细胞形态，以及CAF标志物降低（敲低过表达试验验证NNMT影响细胞表型）。

    NNMT与EMT标记物的表达和EMT的转录调节因子有关，NNMT的抑制作用减弱了正常基质细胞对TGF-β的反应而获得的CAF标记物。成纤维细胞或CAF中由NNMT差异表达的基因显著富集了与上皮间充质转化、TCGA间充质亚型和基质中高表达蛋白相关的基因标记（转录组水平评估下游基因表达）。正常成纤维细胞中NNMT的过表达促进癌细胞增殖，敲低CAF中的NNMT会减弱癌细胞的增殖和趋化性（敲低过表达试验验证NNMT影响细胞表型）。

图2，NNMT在HGSC转移的基质中上调并调节CAF表型。（a）NNMT催化反应性甲基从S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）转移至烟酰胺（NA），生成S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）和代谢惰性的产物1-甲基烟酰胺（1 -MNA），从而耗尽SAM并降低总体细胞甲基化潜力；（b）NNMT免疫组化发现其在网膜转移基质中表达升高；（c）网膜和腹膜转移中基质NNMT表达升高；（d）敲低CAF中的NNMT导致成纤维细胞形态变长；（e）1-MNA的产生在敲低时减弱，并且在NNMT的过表达时增强；（f）敲低或过表达NNMT后，CAF标记的免疫印迹；（g）NNMT过表达或敲低对胶原蛋白收缩力的影响；（h）NNMT的敲低或过表达后显著差异表达的基因；（i）NNMT过度表达时，细胞增殖率增加，敲低后增殖率降低；（j）shCtrl的CAF的条件培养基的趋化性的定量。

3    NNMT通过调控DNA和组蛋白的甲基化驱动CAF表型

    甲基化潜力直接由NNMT表达调节，类似地，作者从多个角度探讨NNMT对甲基化的影响。NNMT表达诱导全基因组DNA甲基化变化，显著改变基因启动子区域的甲基化状态，下游基因涉及胶原蛋白生产和肌球蛋白驱动的收缩（检测受NNMT影响的DNA甲基化状态）。5-氮杂胞苷抑制DNA甲基化可增加CAF标志物的表达和胶原蛋白的收缩力，支持DNA低甲基化在调节CAF表型中的直接作用（验证DNA甲基化影响细胞表型）。

    为了解NNMT如何影响组蛋白甲基化，作者进行了针对性的组蛋白蛋白质组学分析。NNMT敲低增加了与转录调控相关的残基处的组蛋白甲基化，包括H3K4和H3K27三甲基化（组蛋白蛋白质组学分析评估NNMT影响组蛋白甲基化）。免疫印迹证实，在敲低或过度表达NNMT时，H3K27和H3K4三甲基化受到干扰。过度达NNMT的细胞ChIP-seq发现NNMT活性降低了H3K27占有率，包括在NNMT调控基因的启动子处（敲低过表达试验验证NNMT影响甲基化）。这些数据均表明，NNMT通过抑制染色质标记的低甲基化介导全基因组表观遗传和转录变化。EZH2组蛋白甲基转移酶抑制剂DZNep，一般组蛋白甲基转移酶抑制剂3DZA，或敲低EZH2处理表达shNNMT的CAF可以恢复CAF标志物的表达并促进胶原的收缩性。总之，NNMT通过降低DNA、RNA或者组蛋白的甲基化水平，改变基因表达水平，进而调控CAF的表型。

图3，NNMT调节DNA和组蛋白甲基化以驱动CAF表型。（a）敲低或过表达NNMT后对SAM、SAH的定量；（b）CAF转录起始位点1500 bp中的DNA甲基化程度；（c）CAF中的定量组蛋白甲基化蛋白质组学；（d）H3K4me3和H3K27me3在NNMT被抑制或过表达的原代成纤维细胞中的免疫印迹；（e）过表达NNMT的正常成纤维细胞的H3K27me3 ChIP测序显示，NNMT表达降低了转录起始位点（TSS）附近的H3K27me3占用；（f）通过qPCR测定的过表达NNMT的成纤维细胞中H3K27me3在Comp启动子上的富集；（g）成纤维细胞标志物的免疫印迹；（h）表达shNNMT并用EZH2组蛋白甲基转移酶抑制剂DZNep处理的CAF的胶原蛋白收缩性。

4    基质的NNMT参与了肿瘤转移进程并且与预后不良相关

    最后，作者利用小鼠模型对上述发现进行体内试验验证，并结合患者临床数据证实NNMT的预后价值。在HGSC转移的同系模型中，当用过表达NNMT的成纤维细胞的条件培养基预处理ID8细胞后，癌细胞向网膜的转移显著增加。体内NNMT的敲除减少了肿瘤细胞增殖和增加基质H3K27三甲基化，降低了总体肿瘤负担，但不影响CAF或OvCa细胞的活力。尽管NNMT主要在网膜转移的基质中表达，但部分患者在主要部位具有较高的NNMT基质表达。作者发现在原发部位高基质NNMT蛋白表达与病人生存期更短且预后更差，而在肿瘤组织中NNMT高表达的病人却并没有显著差异，突出了隔离专项研究的重要性。

图4，基质NNMT支持HGSC进展，并与不良预后相关。（a）小鼠实验设计示意图，以及腹膜内注射GFP标记的OvCa细胞后的代表性图像和网膜粘连的定量分析；（b）注射CAF的OvCa细胞的体内增殖和总肿瘤负荷；（c）CAF中NNMT沉默导致组蛋白甲基化增加；（d）NNMT沉默的OvCa细胞注射后小鼠的肿瘤负荷；（e）NNMT表达与患者预后的Kaplan-Meier生存曲线；（f）间质NNMT通过组蛋白甲基化的代谢调节来驱动卵巢癌进展，这会导致基质细胞的表观遗传和转录变化，从而促进癌细胞的增殖，迁移和转移。

讨 论

    本研究通过对从STIC到转移性肿瘤的HGSC进展系列中的肿瘤和基质区室进行蛋白质组分析，揭示了转移性基质签名。研究结果强调了卵巢癌的分子异质性，同时还揭示了个体患者的肿瘤蛋白质组在进展过程中相对稳定。尽管上皮OvCa在患者之间具有明显的遗传和蛋白质组学异质性，但转移性基质蛋白却非常均匀，并且具有较高的NNMT表达以及NNMT调控的基因和蛋白质表达。NNMT通过代谢方式重新编程基质的表观基因组，以选择干细胞启动、代谢综合征和肿瘤侵袭性期间发生的NNMT依赖性过程，CAF基因的表达可以通过染色质修饰和DNA甲基化来调节。NNMT活性的抑制导致CAF表型的逆转，这表明基质甲基转移酶活性可以作为正常化转移基质的靶标，应进一步探索作为癌症的新治疗靶标。