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RepeatExplorer所在服务器为BioStar -
Introduction
RepeatExplorer是一个用于发现和描述真核生物基因组重复序列特征的computational pipeline（计算流程）。该算法最初是为在植物基因组中分析寻找重复序列而量身定制的，所以对于非植物界的物种，有些参数选项需要自定义，以提高灵敏度；
输入数据（input）：高通量测序数据
算法：图聚类分析（graph-based clustering analysis）
算法介绍：Graph-based clustering and characterization of repetitive sequences in next-generation sequencing data
所在服务器及注册位置：https://galaxy-elixir.cerit-sc.cz/
Repeatexplorer介绍文献：RepeatExplorer: a Galaxy-based web server for genome-wide characterization of eukaryotic repetitive elements from next generation sequence reads -
数据的上传与下载
- 通过浏览器传输
使用Get Data --> Upload File上传数据，一次限制上传不大于2GB的文件；
可以使用软盘图标从“dataset”菜单下载数据集，该种方式只适于下载单个文件(e.g. compressed archives of clustering results)； - 保险起见，建议使用FTP传输
上传：
curl -T [ my_data_filename ] -k -v -u [ username ] ftps://repeatexplorer-elixir.cerit-sc.cz/
会有弹窗输入登录密码，这样上传的数据在Tools --> Get Data --> Upload File --> Files uploaded via FTP中，选择要导入的文件，然后点击“Execute”按钮。一旦导入，文件将从列表中删除。
下载：
需要先在浏览器界面用Tools --> Repeat Explorer --> EXPERIMENTAL TOOLS --> Transfer data to ftp server 将选择好的要下载的内容传输到ftp服务器，再在自己客户端输入以下内容
curl -C - -o [ local_output_filename ] -k -v -u [ username ] ftps://repeatexplorer-elixir.cerit-sc.cz/[ server_output_filename ]
会有弹窗输入密码，可以通过查看md5sum文件检测文件传输是否完整 - 从EBI SRA下载数据
用Get Data --> EBI SRA在EBI上下载公开可用的数据集。
- 通过浏览器传输
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界面button与功能
实用工具NGS: QC and manipulation
| button | 功能 |
|---|---|
| (ILLUMINA FASTQ) FASTQ Groomer | Groomer需要第一个运行，以便用其他工具处理fastq文件。（需要注意选择合适的fastq质量分数类型） |
| (FASTQC: FASTQ/SAM/BAM) FASTQC | 检测高通量测序数据的质量，如reads序列上的质量分数的分布、读长分布以及序列中不能确定的碱基数量； |
| (FASTX-TOOLKIT FOR FASTQ DATA) Filter by quality | 舍弃低质量reads。通过质量统计画出质量分数箱图和碱基分布表，从而评估数据质量。该过程可选； |
| (GENERIC FASTQ MANIPULATION) FASTQ to FASTA converter | 作为最后一步，将reads的格式转为FASTA。 |
附加工具Utilities
| button | 功能 |
|---|---|
| Preprocessing of fastq paired-reads | 处理双端测序fastq格式的reads，包括trimming, quality filtering, adapter filtering (cutadapt) and interlacing. |
| Preprocessing of fastq reads | 处理单端测序fastq格式的reads，包括trimming, quality filtering, adapter filtering (cutadapt) and sampling. |
| FASTA read name affixer | 在FASTA文件中序列的名字前后附上前后缀； |
| Sequence sampling | 在数据集中随机取序列； |
| FASTQ Read name affixer | FASTQ文件中序列的名字前后附上前后缀，去掉空格； |
| Rename Sequences | 用数字替代FASTA文件中的reads名称，这样有助于保留原始名称； |
| FASTA interlacer | 将不同文件中的paired reads合并成一个single interlaced file, 在该文件中相同pair被并列放在一起。该过程要求第一个文件每个read在第二个文件中必须要有与之相符的mate,并且得是在相同的position； |
| Scan paired reads | 检测双端测序reads是否有序列重叠，这可能是由于片段过短而造成的； |
| RepeatMasker custom search | 用RepeatMasker检测自定义的repeat数据库中之前的clustering结果； |
| Chip-Seq Mapper | 将ChIP-seq和input reads map到由RepeatExplorer clustering得到的contigs； |
- 参数
| 参数 | 功能 | 注意 |
|---|---|---|
| NGS Reads | 指定FASTA格式文件 | 通常是由Pre-processing tools处理得到的文件. |
| paired-end reads | 如果使用的是paired-end或mate-pair reads数据的话，需要将该项调整为yes | 请使用RepeaExplorer --> Utilities --> FASTA interlacer 来完成此项准备，不要用NGS:QC and manipulation中的FASTQ interlacer，因为这个工具会消耗很大的内存，而且该工具只有当你分散的paired序列文件顺序不同时适用。 |
| Sample size | RepeatExplorer2会默认估计总的reads数，只有当你想用该算法运行个小的数据集时才需要设定该参数 | reads数不能低于1000。 |
| Advanced options | 如果你想设置更加复杂的分析时需要将此项调整为yes，比如用自定义的数据库、作多物种比较分析等 | 此处还可以改变一些其他附加参数 |
| Perform comparative analysis | 当你需要分析多个样品时需要将该参数调整为yes, 并需要根据你的数据设置参数Group code length | Group code length是用于标明reads名字中用于区分不同物种的前缀长度。Also, you can append sample codes to read names using one of them 此外，还可以用pre-processing tools read name affixer在reads的名字中附上样品编码 |
| Use custom repeat database | 用于给在clusters中的重复序列分类，对于在RepeatMasker数据库中代表性不足的物种推荐使用此项 | 该数据库得是个含DNA序列的fasta格式文件，而且要在每条序列的fasta名字上标明repeat type/family的信息（e.g., >sequence_id#Copia/Angela），RepeatMasker libraries中用的也是此种格式。自定义的library需要用Get Data --> Upload File上传到服务器。 |
| Cluster size threshold for detailed analysis | 为clusters生成包含各种数据和输出结果的目录。要选择的最小clusters值由一定比例的待分析reads数量决定(e.g., 对1,000,000 reads的数据集用默认值 0.01% 表示：所有包含大于100个reads的clusters将被记入分析) | 不建议将此参数值设置的低于0.01%，因为这可能造成由cluster数量增多导致的计算时间延长 |
| Perform automatic filtering of abundant satellite repeats | 如果想要滤去数据中长片段的卫星重复序列以期让更多reads可以被分析，此项选择yes | |
| Keep original sequence names | 序列的名字默认是会重新命名的，如果想保留最初序列的名称则去掉该选项（不推荐） | 对于双端测序reads若想保留初始名称，需要用最后一个字符来区分左右mates。对于comparative analysis此项不会影响Group code length参数 |
| Perform cluster merging | 此参数在TAREAN analysis中用到，此项合并在双端reads中明显关联的clusters | there are several instances where pairs are split between two clusters (see section on cluster connectivity) |
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输出文件
clustering分析后会在“History”面板中生成四个新条目。 其中log文件和Contigs文件为单个纯文本文件，HTML summery和Archive with clustering results含多个文件，可以以zip格式下载。 HTML summery的输出内容可以用“Display data in browser”选项（眼睛符号）直接查看。 -
双端测序数据的分析流程
双端测序数据clustering分析flowchart
- 参考文章
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