文献科普：m6A甲基化修饰在神经元发育和成体神经形成中的作用研究
近年来研究发现m6A修饰在哺乳动物神经系统的mRNA中普遍存在，并在胚胎期和产后神经元发育过程中表现出动态特征。浙江大学医学院李学坤教授团队多组学联合分析揭示了m6A修饰通过调节组蛋白甲基转移酶Ezh2来调控神经形成和神经元发育，进一步验证了m6A甲基化修饰在神经元发育和成体神经形成中的作用。
标题：m6A Regulates Neurogenesis and Neuronal Development by Modulating Histone Methyltransferase Ezh2（m6A修饰通过调节组蛋白甲基转移酶Ezh2来调控神经形成和神经元发育）
时间：2019.4
期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics
影响因子：IF 7.691
技术平台：MeRIP-seq、m6A MeRIP-qPCR、RNA-seq、ChIP
摘要：
m6A甲基化酶由Mettl3和Mettl14组成，是mRNA中最丰富的RNA修饰，参与多种生物过程。然而，m6A修饰在调控神经元发育和成体神经形成中的作用和确切机制尚不清楚。在本研究种，作者检测了Mettl3在小鼠神经元发育和成体神经形成中的功能，结果发现Mettl3沉默导致成体神经干细胞（adult neural stem cells，ANSC）中m6A修饰水平显著下调，并影响了细胞增殖。Mettl3沉默不仅影响神经元发育，使ANSC分化更倾向于胶质细胞系，而且还影响了新生神经元的形态成熟。m6A-seq（MeRIP-seq）测序分析结果显示m6A修饰主要富集在与神经形成和神经元发育相关的转录本中。从机制上讲，m6A修饰存在于组蛋白甲基转移酶Ezh2的转录本上，mettl3沉默导致Ezh2蛋白表达水平下调，ChIP实验证明H3K27me3水平下调。免疫荧光观察发现，mettl3沉默引起的神经细胞增殖和分化缺陷可被Ezh2过表达所回复。总之，研究结果揭示了RNA修饰和组蛋白修饰之间的串扰，并表明Mettl3介导的m6A修饰通过调节组蛋白甲基转移酶Ezh2表达在调控成体神经形成和神经元发育中发挥重要作用。
实验方法和流程设计
结果
（1）小鼠神经干细胞发育中mettl3的表达动态
（A-D）神经干细胞增殖和分化中mettl3表达动态的免疫荧光观察
（E-F）Western blot检测m6A甲基化酶mettl3和mettl14在增殖和分化中的变化
（I）Dot blot和MS检测增殖和分化过程中总体m6A修饰水平的变化
（2）m6A甲基化酶mettl3调控神经干细胞增殖
（A-B）mettl3沉默实验：RT-PCR和WB验证其表达沉默成功
（C-D）Dot blot和MS验证mettl3沉默导致的m6A修饰水平下调
（E-G）免疫荧光观察：mettl3沉默影响了细胞增殖
（H）RT-PCR检测mettl3沉默导致多种细胞周期蛋白mRNA水平下调
（I-K）流式细胞术分析沉默后细胞周期状态发生改变
（3）m6A甲基化酶mettl3调控神经干细胞分化和发育
（A-E）免疫荧光观察：mettl3沉默和过表达对神经干细胞分化的影响（Tuj1为神经元细胞标志物，GFAP为星形胶质细胞标志物）
（F-G）Western blot：mettl3沉默和过表达对神经干细胞分化的影响
（H-L）Sholl分析检测mettl3沉默和过表达对新生神经元细胞和海马神经元的影响
（I-K）原位电穿孔图像分析mettl3沉默对神经元的数量和长度的影响
（4）神经干细胞从增殖到分化的m6A修饰动态
（A-B）增殖和分化细胞的m6A修饰在转录本上的分布比较
（C）增殖和分化细胞的m6A修饰区域motif分析
（D）增殖和分化细胞中m6A修饰基因的重叠分析
（E-G）共有基因和独有基因的GO功能富集分析
（H）m6A修饰基因和差异表达基因的重叠分析
（I）具有m6A修饰的差异表达基因的GO分析
（J）增殖和分化细胞中几个差异m6A修饰基因的IGV展示
（5）mettl3通过m6A修饰调节基因表达，进而影响神经细胞增殖
（A）mettl3沉默样本的m6Apeak分布、motif分析
（B）mettl3沉默前后的差异表达基因和m6A修饰基因的重叠分析
（C）组学关联分析火山图（九象限图的另一个版本）
（D-E）mettl3沉默后有m6A修饰的上调和下调差异表达基因的GO分析
（F）四个与神经发育功能相关基因在mettl3沉默后m6A修饰水平降低
（G）m6A修饰的差异表达基因功能网络
（6）Ezh2受Mettl3调控，可挽救Mettl3基因下调引起的神经元发育和神经发生缺陷
（A-C）mettl3沉默导致Ezh2蛋白表达水平下调，CHIP实验证明H3K27me3水平下调。
（D-E）mettl3沉默和Ezh2 m6A修饰区引入突变，都不影响Ezh2的mRNA水平
（F-I）免疫荧光观察发现，mettl3沉默引起的神经细胞增殖和分化缺陷可被Ezh2过表达所回复
（D）Ezh2过表达挽救了受损的新生神经元的形态成熟
关于meRIP-seq
MeRIP通过m6A特异性抗体富集和测序，用于研究RNA的腺苷甲基化修饰。易基因自主研发微量RNA甲基化检测技术，样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需5μg总RNA。
关于m6A研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）后期试验
参考文献：
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