circRNA特异性定量引物设计

circRNA成环性检测在circRNA研究中非常关键，通常需要在剪切位点（back-spliced junction）处设计特异性的验证引物。由于已获取的序列为环序列从剪接位点处打开后的线性序列，而按照一般序列线性存储规则（5’至3’方向），为方便引物设计，需要复原序列成环时的位置关系，对序列进行位置变换后再进行设计，如图所示：

图片.png

(1) 单一外显子circRNA：

以hsa_circ_0000234为例，序列为：

">hsa_circ_0000234
ATTTCAACACTACACTTGCACAATGTCTTTGAAACCAAGAGTAGTAGATTTTGATGAAACATGGAACAAACTTTTGACGACAATAAAAGCCGTGGTCATGTTGGAATACGTCGAAAGAGCAACATGGAATGACCGTTTCTCAGATATCTATGCTTTATGTGTGGCCTATCCTGAACCCCTTGGAGAAAGACTTTATACAGAAACTAAGATTTTTTTGGAAAATCATGTTCGGCATTTGCATAAGAGAGTTTTGGAGTCAGAAGAACAAGTACTTGTTATGTATCATAGGTACTGGGAAGAATACAGCAAGGGTGCAGACTATATGGACTGCTTATATAG

1. 获得circRNA序列后。截取3’端100-300 bp（具体长度视circRNA的全长序列而定）左右长度的序列置于5’端之前，形成一个新的序列。本例选择后198bp序列，即加粗碱基部分。

转换后序列:
AGATATCTATGCTTTATGTGTGGCCTATCCTGAACCCCTTGGAGAAAGACTTTATACAGAAACTAAGATTTTTTTGGAAAATCATGTTCGGCATTTGCATAAGAGAGTTTTGGAGTCAGAAGAACAAGTACTTGTTATGTATCATAGGTACTGGGAAGAATACAGCAAGGGTGCAGACTATATGGACTGCTTATATAGATTTCAACACTACACTTGCACAATGTCTTTGAAACCAAGAGTAGTAGATTTTGATGAAACATGGAACAAACTTTTGACGACAATAAAAGCCGTGGTCATGTTGGAATACGTCGAAAGAGCAACATGGAATGACCGTTTCTC

2.根据转换后的序列设计引物，引物设计可以使用Oligo、Primer3等软件。这样的引物也叫作Divergent Primers

上面是手动挡，当然也有自动挡可供选择
利用CircInteractome数据库设计circRNA的siRNA的靶标序列及Divergent primers

图片.png 图片.png

## Primer3 Output
<pre>PRIMER PICKING RESULTS FOR hsa_circ_0000234
No mispriming library specified
Using 1-based sequence positions
OLIGO            [start](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_START) [ len](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_LEN) [     tm](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_TM) [    gc%](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_GC) [  any](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_ANY) [](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_THREE) [  3'](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_REPEAT) [seq](https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3_www_results_help.html#PRIMER_OLIGO_SEQ) 
LEFT PRIMER         59   21   59.89   47.62  4.00  0.00 AGAATACAGCAAGGGTGCAGA
RIGHT PRIMER       196   20   59.50   45.00  3.00  3.00 ACCACGGCTTTTATTGTCGT
SEQUENCE SIZE: 200
INCLUDED REGION SIZE: 200
PRODUCT SIZE: 138, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00
    1 ATAAGAGAGTTTTGGAGTCAGAAGAACAAGTACTTGTTATGTATCATAGGTACTGGGAAG
                                                               >>
   61 AATACAGCAAGGGTGCAGACTATATGGACTGCTTATATAGATTTCAACACTACACTTGCA
      >>>>>>>>>>>>>>>>>>>                                         
  121 CAATGTCTTTGAAACCAAGAGTAGTAGATTTTGATGAAACATGGAACAAACTTTTGACGA
                                                              <<<<
  181 CAATAAAAGCCGTGGTCATG
      <<<<<<<<<<<<<<<<    
</pre>

(2) 多个外显子构成的circRNA

因为circRNA的反向剪切有高度的可变性，可能是exon4单独成环，可能是exon4/5成环，也可能是exon3/4/5或者exon2/3/4/5/6成环，包含exon4的circRNA有多个，此时按上面的方法设计引物，引物实际上可以同时扩增到exon4/5、exon3/4/5或者exon2/3/4/5/6等成环产物，那么引物的特异性就没办法保证了，PCR产物电泳检测很可能是多条带，所以就需要第二种引物了。
跨接点原则设计引物（Sjod Primers）:
下游引物序列要包含头部序列接点碱基以增强特异性。
接点序列选择不能过长，否则可能造成假阳性。

circRNA特异性引物注意事项：
除了要遵循普通引物设计原则以外，circRNA引物设计还应满足以下原则：

对于外显子环化circRNA，引物跨剪切位点处（backsplice junction）设计；
对于内含子环化circRNA，可跨剪切位点处设计，也可围绕内含子区域设计引物；
PCR扩增产物长度最好小于100bp。

参考文献：
环状RNA（circRNA）序列查询及引物设计
环状RNA（circRNA）序列查询和引物设计
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