2020年，大牛团队DeepMind开发的AlphaFold过去掀起了一股热潮，因为它成功预测出了蛋白质的三维结构，迈出了利用人工智能预测蛋白质结构的第一步，目前几乎所有蛋白质的结构都可以通过AlphaFold来进行预测。
但是虽然AlphaFold可以实现对蛋白质单体结构的高精度预测，但蛋白质复合物的预测仍然是一个挑战。2021年10月4日，大牛们又进一步推出了AlphaFold-Multimer，用于蛋白质复合物的预测。AlphaFold一经推出就对生命科学产生了重要的影响，但是是否可以用来解决植物-病原菌互作的科学问题，还鲜有探索。
近期，牛津大学团队在Nature Communications上发表了题为“AlphaFold-Multimer predicts cross-kingdom interactions at the plant-pathogen interface”的研究论文，报道了AlphaFold-Multimer在植物胞间免疫中的应用。
在植物-病原菌互作过程中，病原菌会分泌大量的胞间效应蛋白进入细胞间隙抑制植物的免疫反应。而植物为了保护自己，会分泌水解酶进入细胞间隙抑制病原菌侵染。同时病原菌会通过分泌水解酶抑制子来抑制水解酶的活性进而达到成功侵染的目的。所以解析水解酶与抑制子之间的互作机制一直是该领域内研究的难点。
作者先利用AlphaFold-Multimer测试了已知的两组水解酶和效应蛋白（P69B-Epi1a和Pip1-EpiC2B）之间的关系（图1a）。从输出的pTMscore可以看出P69B-Epi1a的ipTM+pTM score是0.93，而Pip1-EpiC2B的ipTM+pTM score是0.92（图2b）；但是不匹配的互作对的得分就很低，只有0.48和0.47。其实从图中可以看出，单个蛋白的的预测结构还是很OK的，只不过在binding区域对于不结合复合物的预测就差很多（图1c）。5个不同AFM模型的结果显示和ipTM+pTM的结果类似，并且真正的complex的结果score远远显著于不互作的complex，作者画了一个cutoff：0.75（图1d），但是取这个cutoff的原因不太清楚。
图1
基于这个结果，说明AlphaFold-Multimer在鉴定植物-病原菌互作上有一定的准确性。所以，作者把预测的范围扩大了。作者选取了番茄中的6个免疫相关水解酶和7种番茄病原菌分泌的1,879个胞间效应蛋白为研究对象，利用AlphaFold-Multimer进行复合物的预测，共产生56,370个复合物模型，根据预测的pTM+ipTM的分值（大于上面的cutoff 0.75），最终获得376个高置信度的水解酶-抑制子的复合物模型（图2）。
图2
研究者进一步对这376个水解酶-抑制子的复合物模型进行深入分析，按照互作的方式分成了4种类型。4种类型里面，只有36个符合作者互作的预期（图3）。而36个里面，23个是新的候选的complex。23个里面根据在病原菌侵染细下转录表达与否（表1），挑出了15个新型的水解酶-抑制子的复合物模型。
图3
表1
然后作者对于P69B的抑制子进行验证。其中4个纯化出来了（图4a）。然后作者把Epi1和EpiC1作为control也加入了。为了测试对于P69B的抑制作用，纯化的候选抑制剂和将Epi1和EpiC1对照与纯化的P69B做对比。随后用FP-TAMRA标记检测P69B的活性（图4b）。与EpiC1阴性对照相比，和Epi1类似，四种候选抑制剂下P69B的活性降低（图4c）。这些实验数据显示4个新型抑制子蛋白可以显著抑制水解酶P69B的蛋白酶活性。
图4
尽管不同P69B抑制剂的结构多样性，大多数抑制剂结构上具有相似残基的S4和S2口袋。但预测结果显示S1口袋的残基多样化，包括碱性（Lys）和酸性（Asp）残基，以及丝氨酸、天冬酰胺和二硫键（图5）。
图5
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