1. 传统杂交瘤技术简介
杂交瘤技术是最早诞生的单克隆抗体制备技术，也是大家最常采用的一种技术方法。
（1）免疫动物： 小鼠 or 兔子，免疫动物脾脏中，与目标 protein x特异性结合的浆细胞会大量扩增
（2）细胞悬液制备：解离免疫动物脾脏获得单细胞悬液 or 直接获得骨髓、外周血
（3）分选得浆细胞：流式分选 or 磁珠分选（小鼠：B220阴性、CD138阳性）
（4）细胞融合（浆细胞+骨髓瘤）： PEG融合技术，电融合技术
（5）杂交瘤筛选：HAT培养基（骨髓瘤细胞由于营养缺陷无法存活，B细胞无法传代培养，只有杂交瘤细胞同时具备了B细胞和骨髓瘤细胞无限增殖的特点，可以通过HAT培养基筛选）
（6）阳性克隆筛选：抗原抗体杂交（梯度稀释至每孔最多只有1个细胞；加入带标记的抗“特异性抗体”的抗体；筛选阳性反应强烈的细胞）
（7）杂交瘤细胞的增殖：体外培养（培养瓶） or 体内培养（小鼠腹水）
杂交瘤技术简介
人源化小鼠 在提高抗体亲和力和疗效方面有很大优势，同时也没有免疫排斥的顾虑。全人源抗体获批的临床应用也证明，在成药性的相关指标评价中，由人源化小鼠开发的抗体药物表现更好。
2. 杂交瘤开发平台注意事项
2.1 动物免疫
动物免疫的效果直接决定了阳性单克隆抗体的筛选数量及品质
2.1.1 优化免疫原
（1）优选免疫原：具有高纯度的重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子
（2）非蛋白特殊抗原作为有效补充：特异性表达靶点蛋白的核酸，细胞，病毒等（接近天然蛋白）
2.1.2 选择适当的免疫方案
（1）免疫方式：皮下；腹腔；静脉；脾内；淋巴结
（2）免疫周期：常规免疫流程；快速免疫流程
（3）免疫佐剂：弗氏佐剂；磷酸铝佐剂；氢氧化铝佐剂；水包油类佐剂
2.2 杂交瘤融合技术
（1） PEG（聚乙二醇）融合：PEG破坏和干扰细胞膜结构，使其结构发生重排，相邻的质膜重排修复时互相合并在一起，从而使相互接触的细胞发生融合
- 影响因素：PEG分子量；使用浓度；处理时间；反应温度
- 缺点：融合效率低，对细胞伤害大
- 优点：价格便宜，操作简单
（2） 电融合：在高频交流电场的作用下，细胞呈串珠状排列，相邻的细胞呈点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，使质膜发生重拍，相邻细胞完成融合。
- 影响因素：电场强度；脉冲次数；电脉冲作用时间；间隔时间
- 缺点：仪器价格昂贵
- 优点：融合效率高，融合后细胞损伤小
2.3 阳性克隆筛选流程
将目的靶点蛋白包被在酶标板上，加入需要检测的杂交瘤细胞培养上清和酶标二抗、显色底物进行显色，根据吸光度的值判断阳性克隆
常规ELISA筛选流程
2.4 抗体生产
针对 鼠源单抗 可以使用以下方法生产：
（1）动物体内生成法（小鼠腹水法）
- 操作简单
- 腹水中的抗体浓度高、滴度好
- 抗体中混杂小鼠杂蛋白（包括Ig）难获得高纯度抗体
- 容易引入动物病毒污染
- 动物牺牲量大
（2）体外培养法
- 制备抗体品质高，不含杂蛋白、不含动物病毒污染
- 纯化方便
- 适于大规模生产制备
- 无动物福利问题
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