SnpHub提供了一个自动化的数据预处理脚本，在填写了配置文件后运行脚本即可（细节在这里https://esctrionsit.github.io/snphub_tutorial/content/Setup/quick_deploy.html）。

但是，对于某些情况，手动预处理数据仍有优势。因此，本文将介绍SnpHub所需数据的手动预处理步骤。同时，还将介绍SnpHub所需的样本描述文件的格式。

本文采用的数据集搭建的SnpHub实例可点击此处查看。

1. 数据准备

[1] Pont, C., Leroy, T., Seidel, M. et al. Tracing the ancestry of modern bread wheats. Nat Genet 51, 905–911 (2019). https://doi.org/10.1038/s41588-019-0393-z
[2] Appels R, Eversole K, Stein N, et al. Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome[J]. Science, 2018, 361(6403). https://doi.org/10.1126/science.aar7191

数据采用了Pont等于2019年发表的Tracing the ancestry of modern bread wheats中的数据 1。根据文章内容，vcf数据本身可在https://urgi.versailles.inra.fr/download/iwgsc/IWGSC_RefSeq_Annotations/v1.0/iwgsc_refseqv1.0_Whealbi_GWAS.zip下载到。

同时，参照基因组数据采用了IWGSC RefSeq v1.0 2，该数据可于https://urgi.versailles.inra.fr/download/iwgsc/IWGSC_RefSeq_Assemblies/v1.0/iwgsc_refseqv1.0_all_chromosomes.zip下载。

本例中，注释信息采用了IWGSC RefSeq v1.1 annotation，下载链接为https://urgi.versailles.inra.fr/download/iwgsc/IWGSC_RefSeq_Annotations/v1.1/iwgsc_refseqv1.1_genes_2017July06.zip。IWGSC RefSeq v1.1 annotation是同样针对IWGSC RefSeq v1.0参照基因组的更新版本的注释数据。

数据下载完成后，解压缩。

对于Pont等的数据，采用whealbi.unimputed_filtered.vcf.tar.gz文件解压缩后的whealbi.unimputed_filtered.vcf进行下一步。同时，进入下一步的还有包含样本信息的Whealbi_Wheat_final_garden_141013.xlsx文件。

对于IWGSC RefSeq v1.0，采用161010_Chinese_Spring_v1.0_pseudomolecules.fasta文件进行下一步

对于IWGSC RefSeq v1.1 annotation，采用iwgsc_refseqv1.1_genes_2017July06/IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3文件进行下一步。

上述文件均移到同一文件夹中备用。

2. 索引FASTA与GFF3

首先使用SAMtools进行FASTA文件的索引完成后，得到同名的fai文件161010_Chinese_Spring_v1.0_pseudomolecules.fasta.fai

samtools faidx 161010_Chinese_Spring_v1.0_pseudomolecules.fasta

对于GFF3文件，可先进行排序，然后采用bgzip进行压缩。压缩后，使用tabix进行索引。索引后可得到索引文件IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3.gz.csi

sort -k1,1 -k4,4n IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3 > IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3.sorted

mv IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3 IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3.backup

mv IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3.sorted IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3

bgzip < IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3 > IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3.gz

tabix -C -p gff IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3.gz

3. 构建snpEff数据库

通过构建snpEff数据库，即可使用snpEff对vcf/bcf文件进行注释。如果之前没有构建对应snpEff数据库，需要先行构建。

首先下载并解压snpEff。

mkdir Downloads && cd Downloads

# 下载SnpEff
wget http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/snpEff_latest_core.zip

unzip snpEff_latest_core.zip

cd snpEff

完成后，编辑snpEff的配置文件

vi snpEff.config

找到配置文件中Third party databases部分，添加如下内容。其中，开头带有#的是注释信息，第二行的SnphubBuilding.genome : Snphub是数据库信息，数据库名要与接下来的文件夹名相对应。

# Database for this Snphub instance
SnphubBuilding.genome : Snphub

向snpEff添加新数据库信息

接着在snpEff文件夹中，创建文件夹data并进入，然后创建文件夹SnphubBuilding和genomes。将之前准备的gff3文件复制入SnphubBuilding文件夹,并重命名为gene.gff（此处的gff3文件时压缩前的文件）。fasta文件复制入genomes，并重命名为<数据库名>.fa，在此处就是SnphubBuilding.fa

mkdir data && cd data

mkdir SnphubBuilding

mkdir genomes

cp ../../../IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3 SnphubBuilding/

mv SnphubBuilding/IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3 SnphubBuilding/genes.gff

cp ../../../161010_Chinese_Spring_v1.0_pseudomolecules.fasta genomes/

mv genomes/161010_Chinese_Spring_v1.0_pseudomolecules.fasta genomes/SnphubBuilding.fa

返回上级目录，即可使用snpEff开始构建数据库SnphubBuilding了。

cd ../

java -jar snpEff.jar build -gff3 -v SnphubBuilding

构建完成，返回最初目录。

cd ../../

4. VCF文件的处理

首先使用bgzip对VCF文件进行压缩，然后利用bcftools进行索引。

bgzip < whealbi.unimputed_filtered.vcf > whealbi.unimputed_filtered.vcf.gz

bcftools index whealbi.unimputed_filtered.vcf.gz

随后，将vcf文件转化为bcf格式并索引。bcf格式是一种二进制格式，相较于vcf体积更小。

# bcftools concat可以合并多个vcf文件，要求多个文件间样本一致且相同顺序。可用于合并分染色体的VCF或分snp和indel的VCF等场景
# bcftools merge用来合并多个样本不重叠的VCF文件
# bcftools concat file-1.vcf.gz file-2.vcf.gz -Ob -o unannotated.bcf.gz
bcftools concat whealbi.unimputed_filtered.vcf.gz -Ob -o unannotated.bcf.gz
bcftools index unannotated.bcf.gz

对bcf文件进行注释。参数中的SnphubBuilding就是上一节中构建的数据库。

bcftools view unannotated.bcf.gz --threads 3 \
    | java -jar Downloads/snpEff/snpEff.jar -t SnphubBuilding - \
    | bcftools view --threads 3 -o output.ann.bcf.gz -Ob

bcftools index output.ann.bcf.gz

注释完成后，如果不再需要snpEff数据库，可直接将文件夹Downloads删掉。

得到的output.ann.bcf.gz就是注释后的bcf文件。备用。

5. 生成基因索引

基因索引是一个包含了四列的文本文件，用于将基因名作为输入时，SnpHub将其转换为区间。

本文件是一个不含header的文件，第一列为染色体名，第二、三列分别为起止位置，第四列为基因名。列与列之间由\t（tab）分隔。

基因索引文件

本文件可由多种方法生成，此处介绍从gff3文件生成的方法：

gawk -F"[\t=;]" -vOFS="\t" '$3=="gene"{print $1,$4,$5,$10}'  IWGSC_v1.1_HC_20170706.gff3 > geneinfo.txt

采用此命令生成基因索引时，请检查输出的基因索引是否正确。

6. 准备分组文件

分组文件是SnpHub用于读取预分组信息以供用户使用的文件。

本文件是一个不含header的文件，共含2列。第一列为分组名称。第二列为分组所含样本（Accession name），样本间以英文逗号分隔。列与列之间由\t（tab）分隔。

分组文件示例 分组文件每列描述

7. 准备样本名对照表

SnpHub在样本名称上采取了“三样本名策略”，即将VCFID（vcf文件中记录的样本名）、Accession name（用户查询时输入的样本名）和Display name（输出的图中的样本名）分开，从而让用户减少输入量的同时，在图上显示更为详细的内容。

本文件是一个含有header的文件，包含至少三列。前三列的列名分别为vcfID、AccessionName、DisplayName，分别是样本在vcf中记录的名字、用户使用SnpHub查询时输入的名字和在输出的图中显示的名字。每列中的名字都不能重复。

在此三列内容之后，用户可自行定义其他列来描述样本信息，以供用户使用SnpHub时翻阅。

列与列之间由\t（tab）分隔。

共有9列的样本名对照表示例 样本名对照表前三列描述

8. 准备样本地理信息表

SnpHub提供了一种比较不同地区变异发生比例的功能，因而需要各样本的地理信息。对于没有地理信息的样本，可直接不写入本文件。如 不需要本功能，只需要创建一个空文件并将路径写入SnpHub配置文件即可。

本文件是一个不含header的文件，包含四列信息。第一列为样本名（Accession name），第二列为地区描述，第三列为经度，第四列为纬度。

地理信息表示例 地理信息表列描述

9. 准备系统信息文件

SnpHub提供给系统管理员一种方式可以简单介绍某个特定的实例。本文件是可选项，如不需要，只需在配置文件中填写NA

如有信息，建议表中只含一列。

系统信息文件示例