10× Genomics提供了完整的数据分析方案，单细胞数据转录组分析类似，VDJ数据也使用CellRanger软件进行分析，在使用之前，我们先了解其工作原理如何识别和矫正数据。基础知识见单细胞免疫组库VDJ——基础知识（一）。

一、10X cellranger VDJ pipeline工作原理：

1、对barcode和umi进行校正

barcode是已知序列，当有一个碱基匹配不上，如果此片段是低质量的测序，那么就校正为已知的barcode。同样对UMI的校正类似，当有多个count的UMI序列中出现有一条reads有一个错配时，就进行校正。 image.png

2、tirm reads

去掉已知的adapter和引物 image.png

3、组装

image.png

4、注释

关键在于CDR3序列注释，TCR的α链和BCR的轻链中CDR3一般位于V、J区段间，TCR的β链和BCR的重链，CDR3一般位于V、D、J基因片段。另外：CDR3必须起始于C氨基酸，整体长度大约5-27个氨基酸，并且没有终止密码子。有时候不止找到一个CDR3区间，此时将得分最高的最为CDR3区域。 image.png image.png

5、过滤 image.png

6、call cells

区分barcode是来自真实细胞，还是来自背景包括的核酸 image.png image.png

7、将细胞barcode分组生成不同克隆型（指一组含有相同成对的免疫细胞，来源于共同的祖细胞） image.png image.png

二、CellRanger分析操作

cd /data/Analysis/Cellranger
/data/softwares/cellranger-6.1.2/bin/cellranger vdj --id=sample_name \
                 --reference=/data/pipeline/10X_VDJ/database/ref/GRCh38 \
                 --fastqs=/data/Analysis/VDJ/rawdata \
                 --sample=sample_name  \
                 --localcores=8 \
                 --localmem=64 

--id 此分析项目名称，cellranger会生成以此命名的文件夹
--reference 参考基因组，人和小鼠的可在10X官网下载，其余物种可通过cellranger自行构建
--fastqs 原始数据的路径
--sample 原始数据文件名称的前缀
--localcore和--localmem参数是计算资源的设置，根据实际情况设置

三、CellRanger输出的结果

cellranger会产生很多文件，重要的结果都存放在在以id命名的文件夹中的outs文件夹里。这部分内容较多，会单独记录。 image.png

四、mult pipeline联合分析

mult部分可以直接一起分析转录组和VDJ数据，见官网。

image.png
转录组和VDJ的区别：当转录组数据远远大于VDJ发现的细胞数的情况，一般长出现在TCR中，是由于TCR的基因表达量过低，将真实的TCR细胞过滤掉，无法识别，新版的的试剂提高了TCR的识别。当VDJ的细胞数远远大于转录组，一般出现在BCR的数据分析中，BCR基因表达量相对高，或者把背景RNA的当初真实BCR，新pipeline有效降低了假阳性的结果 image.png

参考：
10x Software Downloads
Understanding V(D)J Output
Web Summary