2023年11月21，bioRxiv发表了Peter N. Dodds团队题为“AvrSr27 is a zinc-bound effector with a modular structure important for immune recognition”的研究论文。该论文解析了秆锈菌无毒基因AvrSr27的晶体结构。https://doi.org/10.1101/2023.11.21.567997
秆锈病，由真菌病原菌Puccinia graminis f. sp. tritici (Pgt)引起。小麦病原菌( Pgt ) 是小麦生产和全球粮食安全的主要威胁。Pgt成功定殖的核心是促进感染和定植的蛋白质效应子的分泌，而小麦的免疫是由受体介导的对这些效应子的识别驱动的，从而导致病原体无毒力。在这里，我们报告了富含半胱氨酸的效应子 AvrSr27 的晶体结构，这是Pgt效应子的第三个实验衍生结构。AvrSr27 结构揭示了一种新颖的富含 β 链的模块化折叠，由两个结构相似的域组成，并证实了我们从 AlphaFold2 衍生模型中获得的不良预测。蛋白质内高度普遍的半胱氨酸残基促进 4 个锌分子的协调。利用该结构，我们表明 AvrSr27 的 N 末端结构域足以进行 Sr27 的免疫识别和相互作用。每个 AvrSr27 结构域中的 7-cys 基序序列有助于锌结合，也在两种吸器表达、结构同源的Pgt蛋白中发现。值得注意的是，尽管序列同一性相对较低，但我们发现这些蛋白质可以与 Sr27 结合并触发异源系统和小麦原生质体中的细胞死亡，尽管比 AvrSr27 弱。总的来说，我们的研究结果对于开展免疫受体定制工程作为植物病害解决方案的领域具有重要意义。
AvrSr27 是一种金属结合效应子，优先结合锌离子
三个 AvrSr27 变体在AlphaFold2 (AF2) 数据库中的模型有很大不同，并且所有置信度分数较低。作者利用AF2v2.3.0 再次进行了预测，并再次发现尽管模型整体的置信度较高，但这三个变体的模型之间仍存在显著差异。因此，该团队试图通过试验确定 AvrSr27 蛋白的结构。
首先将带有 N 端可切割 6xHis 标签的 avrSr27-3 在大肠杆菌菌株 SHuffle®中表达（氧化环境）或BL21（还原环境）。使用镍亲和力和尺寸排阻层析 (SEC) 将蛋白质纯化至均质。SEC 和 SDS-PAGE（等体积上样）的 avrSr27-3 峰的比较表明，BL21 的总蛋白产量比 SHuffle® 高约 10 倍（图 1A ）。这表明在还原条件下有利于蛋白质产生，并表明半胱氨酸可能被还原。通过完整质谱 (MS) 测量，由 BL21 或 SHuffle® 产生的 avrSr27-3 的单一同位素质量，对应于与蛋白质还原形式相关的预期理论分子质量 (13518 Da)（图 1B ）。为了进一步证实这一观察结果，BL21 产生的 avrSr27-3 用碘乙胺 (IAA) 进行烷基化，这导致每个游离硫醇/硫醇盐基团的质量增加 57 Da。测量的质量显示出一系列峰，每个峰相距 57 Da，表明发生了不完全烷基化。由于结合的金属离子可能阻碍烷基化，我们在用金属螯合剂 EDTA 预处理后进行烷基化，观察到单同位素质量为 14316 Da 的单峰，与所有半胱氨酸残基的完全烷基化一致（图 1B ）。
为了测试 avrSr27-3 是否与金属离子共纯化，我们在补充有痕量金属溶液的培养基中表达蛋白质，随后在显色螯合剂 4L(2Lpyridylazo) 间苯二酚 (PAR) 存在下使纯化的蛋白质变性。游离 PAR 的最大吸收波长为 416 nm，当形成 PAR-金属离子络合物时，吸收波长会转移至~500 nm（金属相关）。将 PAR 与 avrSr27-3（变性以释放金属离子）一起孵育后，观察到吸光度峰移动至~500 nm，这与 PAR-金属复合物的形成一致（图 1D ）。将 PAR 与 AvrP（一种已知的金属结合效应子）一起孵育时也观察到类似的变化。我们使用电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 确认了 AvrSr27 中金属结合的身份和化学计量。发现AvrSr27仅与锌离子结合，每个AvrSr27单体平均占据2.04个锌离子（图1D）。为了评估 AvrSr27 对金属的特异性和亲和力，我们使用了微尺度热泳 (MST)。我们首先试图通过在非变性条件下用 EDTA 处理来去除 AvrSr27 中结合的锌，但随后使用 PAR 测定和 ICP-MS（SEC 后）进行的分析表明，AvrSr27 仍然与锌结合，其比率与未处理的样品相似（每个 AvrSr27 单体约 1.7 个锌离子）。尽管如此，使用四种过渡金属（Zn 2+、Mg 2+、Ni 2+、Fe 2+）对该蛋白质进行的结合实验表明，该蛋白质仍然可以容纳其他金属。Zn 的亲和力最高（Kd 为 5.2 ± 0.74 μM），而 Ni 的亲和力则低得多（Kd 72.8 ± 7.2 μM）。没有观察到Mg 2+或Fe 2+的结合。总的来说，这些数据表明 AvrSr27 可以优先结合锌，并且每个分子可能容纳 ≥2 个锌离子。
AvrSr27 的结构是一个新颖的重复结构域
为了阐明 AvrSr27 的结构，在大肠杆菌BL21中产生了三个等位基因，并在金属交换步骤后进行结晶筛选，以创建均质的载锌蛋白质样品。获得了 AvrSr27-1 晶体，并使用锌单波长反常衍射 (SAD) 方法将结构解析为最终分辨率 2.4 Å。
该结构由两个反平行β片层和一个短C端螺旋组成（图2A）。在该结构中，有四个锌离子，每个锌离子通过四个半胱氨酸残基（CCCC；Zn2和Zn4）或三个半胱氨酸和一个组氨酸（CCCH；Zn1和Zn3）与四面体配位几何结构结合（图2B ）。两个 β 片层元件（分别为残基 32-86 和 87-146），每个元件都有两个 Zn 配位位点，结构相似（51 个对齐残基的均方根偏差 (RMSD) 为 2.5 Å；图2C） ，表示重复的域，其中第二个域相对于第一个域旋转 180 度。每个结构域包含两个具有替代配位几何形状的锌配位位点（CCCH 和 CCCC）。
有趣的是，在第一个锌配位位点（Zn1）中，三个半胱氨酸残基（C37、C66和C69）与位于C端螺旋的组氨酸（H141）一起配位锌离子（图2B ， C )，它环绕以稳定蛋白质的整体折叠。与 AlphaFold2 v2.3.0 预测的比较表明，AvrSr27-1 和 avrSr27-3 的预测结构与我们实验确定的结构相似（104 个和 92 个残基的 RMSD 分别为~3 Å），但是不是 AvrSr27-2。AvrSr27-1 的 AlphaFold2 (AF2) 预测中锌配位残基的位置是准确的，除了第一个结合位点的配位 His 残基不同（晶体结构中的 His33 与 His141） 。此外，avrSr27-3 AF2 结构预测了 Zn 配位点中半胱氨酸残基之间的几个二硫键。
AvrSr27-1 在效应子中具有新颖的结构，尽管在使用 DALI 网络服务器对蛋白质数据库 (PDB) 进行结构搜索后，观察到与分子伴侣、HSP70 和 DnaK 的底物结合域的结构相似性有限。然而，与 AvrSr27 蛋白不同，这些结构域不结合金属离子，AvrSr27 也不包含 HSP70 和 DnaK 功能所需的额外核苷酸结合结构域，这表明它不太可能具有相同的功能作用。
对来自Pgt的两种蛋白质进行结构信息鉴定，这些蛋白质可被 Sr27 识别并直接与 Sr27 相互作用
AvrSr27 的两个重复结构域在 Zn 配位半胱氨酸残基之间包含相同的间距（图 2C）。对该基序（CX 13 CX 2 CX 11 CX 2 CX 9 CX 4 C；其中 X 是任何残基）的搜索从Pgt21-0分泌组中鉴定出两种蛋白质：Pgt21-028479 和 Pgt21-027343。这些蛋白质彼此之间具有~95%的序列同一性，与三个AvrSr27等位基因具有~50%的序列同一性（图3A），并且在吸器中高度表达。鉴于> 30％序列同一性的蛋白质通常采用相似的折叠，我们预测Pgt21-028479和Pgt21-027343是AvrSr27的结构同源物。
有趣的是，Pgt21-027343与Sr27在本塞姆氏烟草中的瞬时共表达导致细胞死亡响应，比AvrSr27-1稍弱，而Pgt21-028479产生相当弱的响应，表明这两种蛋白都可以被Sr27识别（图3B）。AvrSr50 与 Sr27 的共表达被纳入作为阴性对照（图 3B-C），而当与 YFP 共渗透时，观察到 Pgt21-027343 或 Pgt21-028479 缺乏细胞死亡，表明细胞死亡是依赖于 Sr27 识别。Pgt21-027343或Pgt21-028479与Sr27在小麦原生质体中的共表达也导致细胞死亡，如通过表达报道分子YFP的活细胞百分比下降所检测到的（图3D ）。单独表达Pgt21-027343或Pgt21-028479没有显示出反应，而Sr27与AvrSr50的共表达也没有显示出反应。
引入RUBY报告系统检测Sr27和AvrSr27之间的互作
之前的推文中介绍过利用引入RUBY报告系统检测Sr27和AvrSr27之间的互作。想了解的朋友可以点击下面链接阅读。
RUBY报告系统 | 一种新的可直接通过肉眼观察植物组织累积红色甜菜碱的报告系统
Sr27和AvrSr27之间的互作检测
我们最近使用植物双杂交测定表明，Sr27 与 AvrSr27-1、-2 和 -3 物理结合，其中 Ruby 报告基因产生的紫色色素甜菜红素可作为蛋白质-蛋白质相互作用的读数。GAL4BD-Sr27与VP16融合的Pgt21-028479和Pgt21-027343的共表达导致UAS（上游激活序列）-Ruby报告基因的激活和甜菜红素的产生（图3E），表明这些之间的物理关联效应蛋白和Sr27。然而，尽管蛋白质积累到与免疫印迹检测到的相似水平，但甜菜碱积累显著低于Sr27-AvrSr27-1阳性对照观察到的水平（图3E），这表明Pgt21-028479 /Sr27 和 Pgt21-27343/Sr27 关联较弱。
AvrSr27 的 N 端结构域足以识别并与 Sr27 关联
为了研究 Sr27 与 AvrSr27 和 AvrSr27 样蛋白之间相互作用的要求，我们将蛋白分为 N 端和 C 端结构域。对于三个 AvrSr27 等位基因，创建了一个额外的较短构建体（残基 35-86，称为 AvrSr27-N-short），它排除了两个 N 端 His 残基，这可能在缺乏 Zn 配位点的情况下完成第一个 Zn 配位位点这些片段中有 His141（图 2）。
在本塞姆氏烟草和烟草中与Sr27瞬时共表达后，所有AvrSr27 N-末端构建体都观察到强烈的细胞死亡反应，类似于全长AvrSr27蛋白（图4A）。然而，对于AvrSr27-1和AvrSr27-2 C端结构域观察到很少或没有细胞死亡，而对于avrSr27-3仅观察到微弱的反应(图4A)。与 AvrSr27 等位基因不同，Pgt21-027343 和 Pgt21-028479 的 N 端或 C 端构建体均未观察到细胞死亡，当 N 端和 C 端构建体共表达时，也无法恢复对这些蛋白质片段的识别。与 Sr27 一起（图 4B）。
这里作者也利用RUBY报告系统检测了互作强度。
为了研究 AvrSr27 N 末端结构域是否维持了 Sr27 物理关联，我们像以前一样进行了植物内双杂交测定并评估了甜菜红素的产生。对于AvrSr27-1，当与GAL4BD-Sr27共表达时，N端长片段和短片段产生甜菜碱积累，但略少于全长蛋白（图4C），而N端长片段和短片段则产生甜菜碱积累。AvrSr27-2的（短）片段给出了与全长蛋白质相似的水平（图4C）并且avrSr27-3 N-末端（短）结构域显示出与全长蛋白质相似的相互作用。在 AvrSr27 C 端结构域、Pgt21-028479 和 Pgt21-027343 N 或 C 结构域分裂共渗透后，甜菜碱几乎没有积累（图 3C）。所有构建体的蛋白质表达水平相似。
讨论
确定宿主免疫受体效应子识别的分子基础对于了解病原体种群毒力特征的进化非常重要，并且可以支持成功部署针对植物病原体的现有遗传抗性，例如 Pgt。小麦免疫受体 Sr27、Sr35和Sr50 与Pgt中相应的 Avr 蛋白之间的识别是通过直接蛋白质相互作用介导的。我们之前发现，单个氨基酸表面暴露残基的突变足以使 AvrSr50 的毒力等位基因逃避 Sr50 免疫受体的识别，并确定了相互作用表面的一部分。
许多来自丝状植物病原体的候选效应蛋白富含半胱氨酸残基，这些残基通常被认为参与分子内和分子间二硫键，提供结构稳定性。很大程度上，这对于定位于质外体的效应蛋白来说是正确的。相反，递送到胞质溶胶的效应子往往二硫键（和半胱氨酸含量）较低，并且虽然存在含有二硫键的细胞质效应子的例子（例如来自 Magnaporthe oryzae 的 MAX 效应子和来自 Pyrenophora tritici-repentis 的 ToxA），但这些效应子并不必需的半胱氨酸丰富。在这项研究之前，两个富含半胱氨酸的细胞质定位效应子（来自亚麻锈病真菌M. lini的 AvrP 和来自稻瘟病菌M. oryzae的 AvrPii）的结构特征表明，半胱氨酸参与其中配位锌离子。
AvrSr27、AvrP 和 AvrPii 均通过半胱氨酸配位结合金属离子，这表明这可能是富含 cys 的细胞质效应子的共同特征，但其功能仍不清楚。已知锌和其他金属离子的结合在确保蛋白质稳定性和诱导正确折叠方面发挥结构作用，其代替二硫键可以在分泌到植物细胞后提供刚性和保护。然而，锌也被证明对于许多酶的催化活性至关重要。实验证据表明，蛋白质内锌离子的功能取决于配位环境，并且在这些效应子结构中观察到的锌的四面体（CCCC 和 CCCH）配位更能代表结构作用。另一个有趣的可能性是，在感染过程中，真菌中可能会产生未结合锌的金属结合效应物，然后在递送至宿主后可将锌隔离在植物细胞内。锌离子和其他过渡金属在植物生长和生理学中发挥着重要作用，包括响应非生物或生物胁迫，并且它们的细胞内浓度受到严格调节以维持生物过程。据报道，局部高浓度的锌对细菌和真菌有毒，并且为了应对病原体的攻击，植物可以提高局部锌的浓度，从而创造有毒的、不适宜居住的环境，或激活其他植物防御过程。例如，据报道，锌可诱导氧化应激和活性氧（ROS）的产生，这对Pgt等生物营养病原体有效。
在过去几年中，基于人工智能的结构预测器（例如 AlphaFold2）取得了重大进展，并已被证明在效应子研究中非常有用。尽管如此，效应子预测的准确性（与实验结构相比）仍然存在差异。可能造成这种情况的一个因素是多重序列比对的进化深度，它支撑着AlphaFold2，尽管在某些情况下仍不清楚。对于 AvrSr27（变体和结构同源物），尽管序列保守性较高，但预测结果普遍较差且存在差异（图 S1A、S6C）。我们认为锌作为 AvrSr27 辅助因子的贡献以及当前深度学习结构预测算法在预测过程中无法纳入辅助因子可能是造成这种情况的原因。尽管我们注意到 AlphaFold2 在某些情况下已显示出正确预测锌配位位点的能力。
AvrSr27 的模块化结构对宿主 Sr27 免疫受体的识别具有影响。AvrSr27 的 N 端结构域足以识别并与 Sr27 直接相互作用，而 C 端结构域则不被识别。出乎意料的是，当作为全长蛋白共表达时，两个 AvrSr27 样结构同源物（Pgt21-027343 和 Pgt21-028479）也可以与 Sr27 相互作用并诱导细胞死亡，但它们的 N 端和 C 端结构域均未被识别。这种明显的差异表明，在 AvrSr27 等位基因中存在参与介导这种相互作用的保守表面暴露残基，这些残基与 AvrSr27 样结构同源物不同。Pgt21-027343 和 Pgt21-028479 在吸器中和感染期间表现出高表达，但不赋予无毒力表型，因为对 Sr27 有毒的突变体保留了这些基因的完整。感染期间未能触发耐药性可能是由于与 AvrSr27 变体相比，这些蛋白质与 Sr27 之间的关联较弱（图 3B、C）。或者，虽然在真菌中转录，但这些基因可能无法有效翻译，或者翻译的产物可能无法递送至宿主。另一种可能性是这些双结构域蛋白在感染过程中被加工成单结构域，这与 Sr27 可以识别 AvrSr27 蛋白的 N 端结构域但不能识别 Pgt21-027343 和 Pgt21-028479 的 N 端结构域的观察结果一致（图 1）。4A、B )。
可以说我们队实验结果的描述，应该总是围绕某一具体生物学过程。
连同之前在植物中观察到的由低表达avrSr27-3毒力等位基因编码的蛋白质的识别，这些数据表明共表达的 R 和 Avr 蛋白质之间的识别可能并不总是与感染期间的抗性/毒力表型相关。因此在缺乏感染表型数据的情况下解释此类实验时需要谨慎。
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