数字 PCR( Digital PCR，dPCR)是继实时荧光定量 PCR( Real-time quantitative PCR，qPCR) 之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行 PCR 扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统 PCR 技术相比，数字 PCR 技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。近年来，随着微流控技术日臻成熟，基于微流控技术的数字 PCR 技术得到了快速的发展，在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。
1. 技术原理
数字PCR( DigitalPCR，dPCR) 是 20 世纪 90 年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可理解为在大规模平行微反应器内进行单分子水平的荧光PCR 扩增与计数式检测，相较于PCR 技术，能够直接计数 DNA 分子的个数，可实现样品的绝对定量分析。数字PCR 过程主要包括样品的分散、PCR扩增以及荧光信号的采集与数据分析。该技术在有限稀释模式下，使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中，每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个 DNA 模板分子，模板分子的分散符合泊松分布。PCR 扩增结束后有荧光信号单元记为 1，无荧光信号则记为 0，即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式即可计算出DNA 模板分子的起始浓度，原理如图所示。
数字 PCR 原理
理想情况下，当待测样品的 DNA 浓度被稀释到很低水平时，样品溶液被分散到大量的反应单元中，使每个反应单元所含有的 DNA 分子数最多只有一个，这种条件下，可通过对阳性反应单元的数目进行统计，直接确定DNA 模板分子的起始数目。但当测定高浓度模板时，部分反应单元中含有两个或两个以上 DNA 分子，大量 DNA 模板分子的随机分布情况符合泊松分布。因此，DNA 模板分子的绝对浓度可以采用泊松分布概率公式计算。
式(1) 中，λ 是 DNA 模板分子在每个反应单元中的平均拷贝数，p 是反应单元中含有 k 拷贝 DNA 模板分子的概率。λ 相当于样品中 DNA 模板分子的起始拷贝数(c) 稀释了 m 倍(m 为稀释倍数，相当于独立反应单元的体积) ，λ = cm；当 k = 0 时，即反应单元中没有 DNA 模板分子的情况，式(1) 可简化为：
同时，当 k = 0 时，其概率 p(x = 0) 相当于无DNA 模板分子的反应单元数与总的反应单元的比值，即：
式(3) 中，n 是反应单元总数，f 是阳性反应单元数。将式(3) 两边同时取对数即得到：
因此，采用数字PCR 技术进行核酸定量分析时，在已知反应单元总数、稀释倍数以及阳性反应单元数目的条件下，可得到样品中 DNA 模板分子的起始拷贝数。在数字PCR 技术中，待测物原始浓度的定量既不依赖于校准物的标准曲线，也不受扩增效率的影响，避免了由于样品与校准物扩增效率的不同而导致的结果不确定性与不准确性。与PCR技术相比，其定量结果具有更高的准确性和灵敏度。
2. 数字PCR技术的发展史
第一代PCR技术在扩增后，通过凝胶电泳进行分析，仅可获得定性结果。直到20世纪90年代，伴随着生物荧光技术的发展，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)应运而生，并成为核酸定量检测的主流技术，沿用至今。由于qPCR为大体积反应系统，存在较多的背景干扰，无法获得绝对定量结果，随着检测要求的提高，qPCR逐渐无法满足临床一些超高灵敏度、精密度的检测要求。
至20世纪末，Bert Vogelstein 等首次提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，文章正式报道于美国科学院院刊PNAS，并表明该技术可用于发现罕见的癌症突变。2003年，Kinzler和Vogelstein继续完善dPCR，并创建了一种改进的方法，他们将其称为BEAMing技术，即“珠子，乳状液，扩增和磁性”的首字母缩写。BEAMing技术使用乳状液在单个试管中分隔扩增反应。这一变化能在一次运行中将该PCR扩展到成千上万的反应。自此，关于dPCR两种形式（芯片式和液滴式）的基本方法都已经建立，企业界的大佬也正式开启了dPCR的商业化进程。发展到现在，市面上常见的dPCR主要有两种：微滴式dPCR（dropletdPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技术。由于芯片式dPCR制造芯片的成本较高，目前微滴式dPCR正越来越受到企业的认可。
ddPCR主要有Bio-rad公司开发的QX200系统和RainDrop系统，QX200可以将体系分割成2万个微滴，Rain Drop可以分割成100万-1000万个微滴。通过将一个待分析的PCR反应体系进行微滴化处理，利用微滴发生器制成近20000个油包水小微滴从而对原始体系进行分割，样品中的核酸分子随机分配到大量独立的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检核酸分子。对微滴体系进行扩增反应以后，分析每个微滴的荧光信号，进行有或无的判断，将判断结果按照泊松分布的原理，通过读取靶标和内参核酸的阳性微滴个数以及比例从而得到靶分子的拷贝数及浓度。与芯片式dPCR相比，操作简单，可以实现高通量的检测，也保证一定程度上的微滴检测稳定性。
Bio-Rad的微滴数字PCR
3. 数字PCR技术的优势
3.1 绝对定量
常规PCR和实时荧光PCR定量检测都需要已知拷贝数的标准DNA制定标准曲线，由于样品测定在各种条件上不会完全一致，会造成PCR扩增效率的差异，从而影响定量结果的准确性。而ddPCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可以进行绝对定量。
3.2 样品需求量低
在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。
3.3 高灵敏度
ddPCR本质上是将一个传统的PCR反应分成了数万个独立的PCR反应，在这些反应中可以精确地检测到很小的目的片段的差异、单拷贝甚至是低浓度混杂样品，且能避免非同源异质双链的形成。
3.4 高耐受性
由于目的序列被分配到多个微滴中，显著降低了体系间的影响以及背景序列和抑制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。尽管dPCR被称作第三代PCR技术，但是客观地来看，dPCR技术逐渐显现出一些不足之处。通量不高、操作复杂，同时成本大大增加，dPCR似乎还没有找到相对qPCR足够的不可取代性优势。另一方面，dPCR增加了很多技术难点，如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR扩增，如何进行灵敏的信号检测和分析，如何提高自动化程度，实现Sample-In Result-Out。相较于Digital ELISA能够提高免疫检测的灵敏度到fg/mL级别，实现了高敏蛋白的检测，dPCR尽管发展更早，却难以取得Killer Application，或许这也导致了所谓的第三代PCR在很多人看来却没那么“下一代”。
4. 数字PCR的应用
4.1 在突变检测方面的应用
常规组织和血液等样品中，由于单个突变的体细胞含量低，使得检出其存在变得困难。而 dPCR 可对复杂的大背景进行有限的稀释或分区，通过有限稀释，降低野生基因型的背景信号，使得低丰度的目的序列能够被灵敏的检出，特别适用于稀有突变的检测应用。研究表明，低至 1/100000 的变异频率能被检测出来。并且随着反应室数量的增加，对稀有变异的分析更灵敏。
4.2 在拷贝数变异检测方面的应用
通常基因表达分析依赖于琼脂糖凝胶电泳、realtime PCR 等方法，拷贝数的确定总是受到限制。而使用 dPCR 进行直接计数目标基因和参照基因的双重反应，通过计算比值，便可直接得到目标基因的拷贝数。
4.3 在微生物检测方面的应用
核酸扩增技术是病原微生物检测的一个重要方法，但可能存在的问题是，有时候低水平目标分子和小分子抑制剂的存在使得检测定量的结果发生偏移。dPCR 则是一种不需要标准曲线并且对部分抑制剂不灵敏的检出方法。因此，研究人员纷纷将其应用于一些病毒或致病菌的检测研究中，如 HBV、肠病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分支杆菌、产志贺毒素大肠杆菌等。
4.4 在转基因食品检测方面的应用
欧盟国家对转基因食品有着严格的限定，而目前，一般采用实时定量 PCR 用于商品中转基因的分子定量分析。但是在一些复杂的食物原料和饲料原材料中，目标DNA非常少，使得对其的检测和定量受到限制。dPCR 为国内外研究人员提供了新的方法。Morisset等用ddPCR对MON810 转基因和hmg 玉米参考基因进行绝对定量。研究表明，ddPCR 对低浓度的检测具有更高的重复性，并且对抑制剂具有更高耐受性。Dobnik 等用多重 ddPCR 检测定量 12 个欧盟授权转基因玉米，对于含转基因组织样品中，该方法比实时定量 PCR 更高通量、更高效。
4.5 在下一代测序方面的应用
dPCR平台可以与 NGS 对接，实现对测序文库的质量控制、提供对测序文库的定量分析和质量评估信息。一方面，dPCR 对 NGS 的测序结果进行验证，对诸如单核苷酸多态性，突变及拷贝数变异在内的基因组变异进行验证，确保测序结果的可信度；另一方面，所得到的结果还包含反映测序文库质量的信息，如接头与接头二聚体、错误连接片段、过长连接片段等，这是当前其他方法所不具备的优势。Alikian 等研究表明，在慢性粒细胞白血病患者的检测中，dPCR 比 qPCR 更准确，定量分析结果可靠性高、重复性好。 目前，市场上已有多款商业化的数字PCR 仪器出现，对进一步拓展和深化数字PCR 技术的应用具有积极的促进作用。未来如果能有效解决 dPCR 耗材成本高、实验通量少等问题和实现操作智能化，dPCR 将在临床诊断与治疗、微生物检测和食品安全检测等方面拥有更广阔的应用前景。
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