NGS003 NGS接头

作者: caoqiansheng | 来源:发表于2020-04-17 11:02 被阅读0次

我们在测序的过程中，需要构建含有接头序列的文库分子，对于我们大部分实验人员来说，只是知道接头连接是如何操作，但是对于接头的作用及结构可能并不太清楚，以illumina文库为例，完整的文库分子需含有与flowcell芯片上锚定的oligo互补序列（P5/P7 tail），index，测序引物读取位点，index引物读取位点，可能还会有UMI序列，详见下图

完整文库结构
接下来我们对接头的分类进行介绍，其实之前的笔记也有提到部分，请参考：测序基础介绍-illumina测序

1. 根据Index位置可以将接头分为单端Index接头和双端Index接头。单端Index接头指的是仅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端），双端Index接头指的在P5和P7端均存在Index。
  
  IDT单端及双端接头
2.根据接头是否匹配PCR free建库可以将接头分为长接头和短接头。长接头又称为完整接头，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接头通过TA克隆的方式连接到DNA片段之后，可不进行PCR扩增反应直接上机测序（DNA量足够上机测序时可直接上机，当DNA量不够时还需进行PCR扩增使得产物达到一定的量方可上机测序）。短接头通过TA克隆方式连接到DNA片段上后，必须与短接头互补的引物进行PCR扩增，扩增产物就是包含完整接头的DNA片段。也即短接头最终一定要通过PCR扩增成为完整接头才能上机测序

IDT 长接头
IDT短接头
3.根据适用的平台不同，接头也是不同，本篇仅对illumina及MGI平台接头进行介绍
3.1 Illumina接头
https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html
IDT 接头序列（illumina）
3.2 MGI接头
https://www.mgitech.cn/download/files/?q=%E6%8E%A5%E5%A4%B4
华大MGI平台单端index接头序列详见下图：
华大接头序列
1. 接头修饰
  以Illumina平台的Y型接头为例，两条DNA链，一条5’端磷酸修饰，一条3’端几个碱基一般带有硫代修饰，标记为TCT或TC*T。
  接头序列及修饰
  硫代修饰是为了防止末端的Overhanging T碱基在连接的过程中被体系中的核酸酶“误伤”；5’磷酸修饰主要功能是A-T连接的过程中形成磷酸二酯键。