大家好，今天要分享解读一篇发表于RNA Biology（IF 4.652）上的关于人类microRNA中(h)m5C修饰位点检测的文章，本文通过研究作者改良的BS-miRNA-seq技术和MAmBA分析流程获得了人类microRNA上(h)m5C修饰的高分辨率图谱，发现该修饰在人miRNA上广泛分布且不仅限于CpG序列，并通过免疫沉淀实验进一步证实，m5C与hm5C修饰均存在于人类miRNA上。
期刊介绍：
RNA Biology (RB)：RB是RNA研究领域的经典杂志和领先期刊，刊登包括转录和剪接、转录后调控基因表达、非编码RNA、RNA定位、RNA翻译、RNA在疾病和治疗等方面的研究文章、简报、综述和评述等。
关于(h)m5C
5-甲基胞苷(5-methyl-Cytosine）和5-羟甲基胞苷(5-hydroxy methyl-Cytosine)是转录组修饰的一种，除了mRNA，在许多非编码RNA(tRNA、rRAN)中也有发现，有研究表明m5C修饰参与调节了这些分子二级结构的稳定。TET酶家族能将m5C转化为hm5C，但在哺乳动物中还未对hm5C进行广泛的研究。
目前检测m5C和hm5C修饰的方法，一是通过亚硫酸盐处理，二是通过能够捕获m5C或hm5C的特异性抗体。亚硫酸盐处理是较为基础的方法，对处理过的分子序列进行测序，能够在单核苷酸分辨率下定量分析甲基化水平，但不能区分m5C和hm5C。基于抗体免疫沉淀的方法允许对每种修饰进行特异性检测，但不能提供关于包含修饰的分子比例的定量结果。
标题：Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human microRNAs
期刊：RNA Biology (RB)
2021影响因子(IF)：4.652
发表时间：2021.6.7
技术平台：BS-miRNA-seq、MAmBA
1、研究目的：
由于存在大量小片段RNA，在一般的BS-RNA-seq数据集中，映射到miRNA的reads极其少量，因此无法全面分析miRNAs中的甲基化修饰。在Cheray等人研究文章里的RNA数据集中，映射到miRNAs的reads百分比也只有大约0.25%。因此，作者开发了一种基于亚硫酸盐处理的高通量NGS策略，以单核苷酸分辨率系统地分析miRNAs中的(h)m5C，即BS-miRNA-seq，和专用的分析流程(BS-miRNA的甲基化评估，MAmBA)，快速检测和分析miRNA中的(h)m5C。
2、项目设计：
2.1 样本选取：
培养海拉宫颈癌细胞(HeLaS3)、人肾脏细胞(HEK293T)、人外周血单核细胞(PBMC)，从中提取总RNA样本。
2.2 项目设计流程图：
3.实验结果
3.1亚硫酸盐microRNA测序方法(BS-miRNA-seq)的建立
本研究通过开发一种优化的亚硫酸盐测序，以单核苷酸分辨率分析人类细胞microRNA上的(h)m5C修饰。由于亚硫酸盐处理会导致RNA片段化，大多数RNA的reads来自tRNA片段，导致miRNA reads的覆盖率非常低，范围在0.0001%至0.0345%之间。
通过PAGE纯化的方法，从总RNA中特异性分离miRNA (长度15-35nt)，分离纯化后的RNA 进行亚硫酸盐处理和测序，该方法—亚硫酸盐microRNA测序”(BS-miRNA-seq)使测序数据集中映射到miRNA的reads增加了约40倍。
3.2 MAmBA：分析miRNA中(h)m5c的生信工具
分析步骤：
(1)对BS-RNA测序数据进行接头处理;
(2)用bowtie2比对tRNA和rRNA数据库，过滤tRNA和rRNA片段;
(3)用tophat2将过滤后的RNA数据与完整的转录组比对;
(4)用bedtools计算所有C位点的覆盖范围和非转换率;
(5)用bisRNA包生成甲基化报告，突出miRNA位点和显著甲基化位点。
MAmBA分析包提供人类(hg38)和小鼠(mm10)基因组，以及为任何物种生成定制MAmBA参考的工具，还包括一个基因组组装(包含匹配的bowtie2指数)、tRNA和rRNA的fasta文件、转录组注释GTF文件(包括miRNA转录本)，和miRBase注释。在一个8核电脑上以最小内存为一个大基因组(如hg38)生成参考序列仅需半个小时。所有脚本和软件均可从https://github.com/flcvlr/MAmBA.下载。
3.3 转化效率
BS-RNA-seq分析的关键是评估亚硫酸盐处理后C到U的转化效率。文章采用tRNAGly(GCC) 5ʹ端31nt的内源性小RNA片段作为对照，其大小与miRNAs相似，评估从C到U的转化效率在98.7%到99.9%之间，平均为99.4%。
3.4 miRNA上的(h)m5C图谱
在被分析的样本中，有40%的miRNA存在一个或多个C碱基的甲基化。部分miRNA在两个不同细胞系中存在非常相似的特征(hsa-miR-10a, hsa-miR-17, hsa-miR-186)，其他的miRNA有细胞系特异性的非转化模式(例如hsa-miR-339)。另外有部分样本上甲基化的C碱基在microRNA全长上都有存在( hsa-miR-10a)，还有部分microRNA只有一个甲基化C碱基(hsa-miR-17, hsa - mir - 339)。
3.5 miRNA甲基化位点与序列之间的关系
研究分析了人miRNA中的甲基化位点是否与特定的序列相关。但通过MEME Suite和WebLogo的分析表明，邻近的序列不影响(h)m5C修饰，实际上在完全不同的序列中也发现了甲基化C碱基，无法通过比对发现任何与(h)m5C显著相关的序列。这一发现与之前的研究结果一致，哺乳动物RNA上的m5C并不局限于CpG区域。
3.6 抗体免疫沉淀(MeRIP)
因为亚硫酸盐测序无法区分hm5C和m5C，因此作者采用m5C以及hm5C的特异性抗体富集的方法，通过RNA免疫沉淀(meRIP)来证实(h)m5C在miRNA中的存在。但在DNA免疫沉淀中使用的5mC抗体在RNA环境中很难结合m5C，文章作者使用了最新开发的32E2单克隆抗体m5C IP用于富集带有m5C的miRNA，另外由于缺乏RNA中专门针对hm5C的抗体，作者采用了在DNA环境中识别5hmC的抗体用于富集带有hm5C的miRNA。
根据BS-miRNA-seq结果，阴性对照设置为未含有甲基化的miRNA(hsa-miR-21-5p)和序列中不含任何C碱基的miRNA (hsa-let-7 f-5p)。数据采用hsa-let -7a-5p进行归一化，其序列中也不包含任何C碱基。
通过RT-qPCR检测，分析发现miR- 25-3p、miR-125a-5p和miR-191-5p均存在m5C-和hm5C-IP特异性富集。虽然测试的miRNAs数量相对较少，但该结果表明，人miRNAs中的一部分C碱基被甲基化成m5C，并进一步氧化成hm5C。这是迄今为止，首次在microRNA中证实hm5C的存在。
4、关键图形
易基因小结
研究作者通过基于亚硫酸盐处理的高通量NGS策略，以单核苷酸分辨率系统地检测了人类细胞系和人外周血单核细胞(PBMC)中miRNAs上的(h)m5C修饰，并通过开发的专用的分析流程(MAmBA)分析了样本中的(h)m5C甲基化图谱，发现(h)m5C是人miRNAs中广泛存在的修饰，并不局限于CG序列，并且通过m5C和hm5C的抗体免疫沉淀验证了实验结果，也首次表明了人类miRNA包含hm5C修饰。
参考文献：doi.org/10.1038/s41422-020-00465-7
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