Article title：A Preliminary Study on the Pattern, the Physiological Bases and the Molecular Mechanism of the Adductor Muscle Scar Pigmentation in Pacific Oyster Crassostrea gigas

期刊：Frontiers in Physiology

发表时间：2017

通讯作者：王晓通

摘要

太平洋牡蛎（Pacific oyster Crassostrea gigas）闭壳肌痕（adductor muscle scar）上以及壳的外表面的黑色素沉着（melanin pigmentation）都是具有吸引力的性状，然而他们的色素沉积模式以及机制目前仍未知。为了研究这种色素沉积模式，作者对同一侧的闭壳肌痕的颜色以及贝壳外表面的颜色做了比较。在闭壳肌痕的颜色以及它所对应的壳的外表面的颜色并没有发现相关性，表明他们的色素沉积的过程是相互独立的。有趣的是，作者发现太平洋牡蛎的闭壳肌痕的颜色以及它的干重之间存在相关性，这也许可以通过与黑色闭壳肌痕相连的外套膜具有较高的羟自由基清除能力（hydroxyl free radical scavenging）来解释。通过RNAseq对具有色素沉积和不具有色素沉积的闭壳肌和外套膜分蘖进行比较后发现视黄醇代谢途径可能与闭壳肌痕以及壳外表面的黑色素沉积有关，并且发现酪氨酸酶或细胞色素P450基因家族的不同成员可能在不同器官独立的色素沉积的过程中发挥了作用。

前言

众所周知，对于软体动物来说壳色是最具有吸引力的性状特征。当前关于软体动物色素沉积的研究主要集中在壳和软体部分的胡萝卜素上，胡萝卜素在猝灭单线态氧物种中具有清除自由基，作为抗氧化剂来支持免疫系统的作用。黑色素具有与胡萝卜素相似的生物学功能，并且牡蛎软体内、壳的外表面以及闭壳肌痕处的黑色色素沉积就是黑色素。

关于牡蛎壳色的遗传机制，大家持有不同的观点。在之前的研究中，研究者们认为牡蛎壳上的色素沉积微多基因控制下的数量性状的连续分布。但是在最近的研究中，壳色被认为是由少数几个主要基因或者是处于相对较高的遗传控制下，狭义遗传力值适中至较高。对太平洋牡蛎的左侧壳色变体（白色、金黄、黑色和部分色素沉积）进行了比较转录组分析，发现有一个酪氨酸酶基因可能与左侧壳的金黄色壳色有关，但是并没有发现与黑色壳色相关的酪氨酸酶基因。闭壳肌筋痕是壳壁分泌的一部分，位于闭壳肌的连接点处行使壳开合壳闭的功能。这种闭壳肌痕颜色多态性的现在在葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）和太平洋牡蛎中都有发现。

然而，闭壳肌筋痕处的颜色和壳色之间的关系仍然未知。因此，在作者的研究中，对太平洋牡蛎闭壳肌筋痕处的颜色以及壳的外表面的颜色进行了比较，确定了色素沉积模式和软体干重之间的关系，并且对闭壳肌筋痕以及壳的外表面的黑色素沉积相关的基因进行了分析。

结果

一、闭壳肌筋痕处的颜色与其所对应的壳的外表面的颜色没有相关性

二、带有黑色闭壳肌筋痕的牡蛎的软体干重要更重一些

这个结果暗示闭壳肌筋痕的颜色与牡蛎软体的干重是具有相关性的，因此黑色闭壳肌筋痕可能会成为一个潜在的育种性状，用于得到干重更大的牡蛎个体。

三、具有黑色筋痕的闭壳肌可能具有更强的羟自由基清除能力（HFRSC）

由图可知，具有黑色筋痕的闭壳肌的羟自由基清除能力（HFRSC），但是丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（TAC）在两个比较组间没有显著差异。

四、白色肌肉和黑色肌肉以及白色外套膜和黑色外套膜的差异表达基因

作者分别对太平洋牡蛎的黑色肌肉、白色肌肉、黑色外套膜和白色外套膜进行了转录组分析，GO富集结果显示与闭壳肌筋痕处的色素沉积相关的本体不同于与壳外表面色素沉积相关的本体。差异表达的酪氨酸酶基因只存在于黑色闭壳肌与白色闭壳肌以及黑色外套膜与白色外套膜相比上调的基因里。在黑色闭壳肌与白色闭壳肌的比较结果中，作者发现了两个显著上调的酪氨酸酶基因（CGI_10011916和CGI_10012743），并且在黑色外套膜和白色外套膜的比较中，作者发现了三个显著上调的酪氨酸酶基因（CGI_10013418,CGI_10017214,CGI_10021076）

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同样的，作者也发现了细胞色素P450基因不仅在黑色闭壳肌中表达上调（CGI_10016640, CGI_10011491, CGI_10017766, and CGI_10028005），在黑色外套膜中也存在上调现象（CGI_10011065 and CGI_10022185），但这两个组织中上调的基因是有区别的。在带有黑色筋痕的闭壳肌与白色的比较中，上调的基因富集在了视黄醇代谢通路中，并且在黑色外套膜与白色外套膜的比较结果中，也富集到了相同的通路，但这两组的上调的差异基因是不同的。In the muscle group, the upregulated genes were Cytochrome P450 1A2, Cytochrome P450 1A2, Cytochrome P450 26A1, Cytochrome P450 3A24, 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 13 and Retinoic acid receptor responder protein 3, but in the mantle group, those were Cytochrome P450 1A1, Retinal dehydrogenase 1, Retinal dehydrogenase 1, Cytochrome P450 3A29, Diacylglycerol O-acyltransferase 1, and Omega-crystallin.

五、共表达的酪氨酸酶基因位于不同的基因簇

六、通过qRT-PCT对RNAseq的结果进行验证

A comparison of qRT-PCR and RNA-seq data of thefive tyrosinase genes was conducted. The results showed that the expression patterns of CGI_10011916, CGI_10012743 in muscle and CGI_10013418 and CGI_10021076 in mantle agreed well between RNA-seq and qRT-PCR, and CGI_10017214 had a similar trend in change of expression pattern between RNA-seq and qRT-PCR。

讨论

一、具有黑色筋痕闭壳肌的牡蛎的软体干重更重的可能的生理学基础

有研究表明鱿鱼墨中的水溶性黑色素组分在清除自由基方面相较于肌肽可能更加有效。含有更多黑色素的黑色闭壳肌可能可以清除自由基。双壳类的闭壳肌由半透明部分和白色部分组成，前者被认为主要负责壳的快速关闭，后者主要负责捕获收缩，以此来保持壳长时间的紧密关闭，长时间保持这种紧张状态能保持较少的能量消耗。根据常识，死亡的牡蛎的壳是完全张开的，因为它的肌肉处于放松的状态，此时处于能耗最低的状态。因此当保持壳处于半开状态时的生理学消耗可能是比较大的，并且当牡蛎张开壳去过滤藻类的时候其闭壳肌的生理学代谢可能非常的强烈。这可能导致产生很多的自由基，像在人体内一样危害牡蛎的肌肉细胞。附着在黑色内收肌筋痕上的闭壳肌可能含有黑色素，可以消除这些自由基，减少闭壳肌的损伤。与白色闭壳肌相比，这些含有黑色筋痕的闭壳肌可能能使他们的壳打开的时间更长，并且过滤更多的藻类，从而促进它的生长率。

二、同一基因家族的不同成员负责牡蛎不同组织各自独立的色素沉积过程

已经有研究证明带有黑色筋痕的闭壳肌连接处含有黑色素，并且一个酪氨酸基因与这个黑色素的产生有关。在这个研究中，研究结果显示这里有两个酪氨酸酶基因在牡蛎的闭壳肌筋痕处的黑色素沉积中可能发挥重要的作用。闭壳肌筋痕可能不仅可以用于控制壳的打开和闭合，还可以参与黑色素的产生。先前的研究表明黑色外套膜所对应的有色素沉积的壳也含有黑色素，并且酪氨酸酶基因在双壳贝类的外套膜中也有所表达，但与软体动物中的黑色素沉积的基因表达无关。然而在这个研究中的结果显示这三个酪氨酸酶基因似乎与牡蛎壳外表面的黑色素沉积有关。

通过酪氨酸酶催化黑色素合成的过程是分为两步，因此，酪氨酸酶基因在黑色素的产生过程中是关键的限速酶。很容易理解闭壳肌筋痕处的色素沉积于壳外表面的色素沉积存在不同是由于编码酪氨酸酶的基因的差异表达所导致的。然而作者注意到通过含有黑色闭壳肌筋痕的闭壳肌与无黑色闭壳肌筋痕的闭壳肌的比较所得出的上调的差异表达的酪氨酸酶基因是不同于黑色外套膜和白色外套膜的比较所得出的上调的差异表达的酪氨酸酶基因的，这也暗示酪氨酸酶基因家族的不同成员可能在不同组织的独立的色素沉积过程中发挥不同的作用。通常人们认为基因簇中相邻基因会发生共表达，但在这个研究中作者并没有发现与酪氨酸酶基因相邻的共表达基因，相反的是，与酪氨酸酶基因不相邻的基因发生了共表达，这也暗示了这些酪氨酸基因的非相邻基因的共表达可能是由于生理功能的需要而不是基因组中的相邻位置所造成的。

细胞色素P450基因家族的不同成员被发现不止存在于含有黑色筋膜的闭壳肌中，而且还存在于黑色外套膜中。这两部分中所发现的上调的差异表达的细胞色素P450基因也是不同的。有研究表明，细胞色素P450参与了灰色链霉菌中黑色素的生物合成，这也暗示了细胞色素P450基因家族的不同成员可能参与了牡蛎不同组织的相互独立的色素沉淀的过程。神经球蛋白和细胞球蛋白属于脊椎动物球蛋白超家族的两个成员，它们在不同的组织中具有相似的生理学功能。在这个研究中，作者同样也发现了这个家族的不同成员在牡蛎的不同组织中发挥了相同的功能（色素沉积）。

三、视黄醇代谢途径可能与牡蛎中黑色素的形成有关

视黄醇（维生素A1）是维生素A在动物中的一种形式，视黄醇脱氢酶可以将维生素A转化成维生素A酸。维生素A酸（又称为视黄酸）可以通过提供酪氨酸酶的活性来诱导黑色素细胞的成熟并且促进黑色素生成的基础水平。有研究同样也报道了视黄醇对于比目鱼的不对称色素沉着的建立具有关键的作用。细胞色素P450可以通过催化维甲酸转换成视黄酸使得它同样也与黑色素的生物合成有关。更重要的是在含有黑色筋痕的闭壳肌与不含有黑色筋痕的闭壳肌的的比较以及黑色外套膜与白色外套膜的比较中所得到的上调的差异基因都富集在了视黄醇代谢途径。

综合这个研究的结果和通路信息，作者提出了牡蛎中黑色素生物合成相关的视黄醇脱氢酶基因和细胞色素P450基因的假设通路。在这个假设的通路中，视黄醇脱氢酶和细胞色素P450影响了维甲酸的产生，较多的维甲酸可以增加酪氨酸酶的活性从而增加黑色素的产生。