新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），简称“新冠肺炎”，已在全世界范围造成巨大的危害，导致数百万人失去生命，对人们的工作和生活造成巨大的影响。其特点是缺氧，迅速恶化，并伴有发展为急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭甚至死亡的风险。由于未能完全了解发病机制和患者间异质性，限制了以biomarker为导向的靶向精确医学方法研究。本文中，研究者利用多组学研究思路，解析新冠肺炎患者血液特征，构建了多组学分子图谱，并与脓毒症和流感患者进行比较，为个性化药物治疗方法的发展奠定基础。
文章题目：A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks of diseaseseverity and specificity
中文题目：新冠肺炎的血液图谱定义了疾病严重程度和特异性的特征
发表时间：2022.03
期刊名称：Cell
影响因子：41.582
实验平台：10x Genomics 单细胞测序多组学+Tims-TOF 4D蛋白质组学检测等技术
DOI：10.1016/j.cell.2022.01.012
研究内容：
· 新冠肺炎的临床特征、严重程度和疾病分级
研究者首先使用质谱流式和CITE-seq技术，以单细胞分辨率在转录组和蛋白质组水平上解析PBMC的类型、亚型和类群（图1A-C）。结果表明，在更严重或危重的病例中中性粒细胞的绝对和相对丰度增加，而T、B淋巴细胞、髓样细胞、树突状细胞（DC）、嗜碱性粒细胞和NK细胞减少（图1D）。在社区型和康复的新冠患者中，细胞组成与健康志愿者大致相似，丰度上存在一些差异。中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、浆母细胞和PDC的频率是影响患者组间细胞组成的重要因素。单独分析住院的新冠肺炎病例时，最大的变异成分（PC1）与组成员、氧合状态和淋巴细胞计数有关（图1F），更高丰度的血小板/CD34-巨核系祖细胞和循环cMono与氧合状态、严重程度和CRP有关。血小板/CD34-巨核系祖细胞丰度也与血栓栓塞的发生有关（图1H），强调了它们在严重新冠肺炎中潜在的病理生理学意义。
Fig.1 单细胞成分分析揭示了不同临床组和严重程度的细胞群差异
· 新冠肺炎全血特征和严重程度涉及中性粒细胞、祖细胞、淋巴细胞耗竭、凝血、免疫球蛋白和干扰素反应
接下来，研究者使用全转录组测序对全血进行解析，以获得宿主对新冠肺炎反应的转录组特征，并发现在不同组间的样品存在明显的分离（图2A）。在住院的新冠患者中，最大的方差分量与28天死亡率相关（PC1）（图2B），与这个成分有关的基因富集于免疫系统功能（尤其是中性粒细胞脱粒）、PD-1信号、抗菌肽和凝血级联。而在不同严重程度患者中差异表达的基因主要富集在TCR和PD-1信号、抗菌肽、显微蛋白凝块形成、整合素和免疫调节相互作用以及血小板和中性粒细胞脱粒（图2C和2D）。与脓毒症相比，新冠肺炎的特点包括许多免疫球蛋白heavy/kappa/lambda基因的上调和与细胞增殖、先天/获得性免疫功能相关的独特通路富集。随后，研究者使用WGCNA分析确定了与新冠肺炎严重程度高度相关的基因模块。MEGrey60模块在危重症新冠肺炎中的表达高于脓毒症，并且ERG基因显示出最高的模块内连接（connectivity）（图2F）。这些结果说明这个模块代表了与严重程度相关的多种祖细胞，进一步支持了这些细胞的重要性。全血中存在不成熟中性粒细胞和中性粒细胞前体细胞，在新冠患者中，中性粒细胞CD49d的表达上升，CD43降低，但在脓毒症患者中基本没有变化，CD49d/CD43比值在恢复期保持较高水平（图2G）。
Fig.2 新冠肺炎的转录组特征
· 新冠肺炎共享和细胞类型特异性的单细胞基因表达特征涉及ZFN、核糖体和细胞周期基因、AP-1和干扰素信号转导
在住院和社区型新冠患者中，研究者发现基因表达的差异主要涉及cMono、幼稚B细胞、浆母细胞、CD4+T细胞和循环NK细胞（图2H）。再次使用WGCNA确定主要细胞亚群的网络模块，在细胞群中发现了一组 I 型 IFN 反应模块，其中具有代表性的基因表达谱（模块特征基因）与较轻的疾病、更好的氧合状态和从症状发作开始的早期采样相关。第二个模块基因富集于AP-1和p38MAPK级联反应基因，第三个模块富含经典 (C2H2) 锌指 (ZNF) 基因，包含 IRF2 和 IL16，第四个模块涉及核糖体蛋白和炎症小体功能，与单核细胞COVID-19严重程度呈负相关。最后，研究者发现了一组“周期”模块，在cMono中与严重程度有关。此外，还鉴定到了CD4+ T细胞中JAK-STAT/白细胞介素信号模块，以及 cMono 中的 EGFR 通路富集模块（图3A-H）。
Fig.3 单细胞基因表达模块鉴定新冠肺炎反应的特征
· 单核细胞群严重程度的转录组和表观遗传学特征
对特异性单核吞噬细胞群进一步分析发现病情程度较重的住院新冠患者cMono比例相对更高，而中间单核细胞、ncMono和DC更低。随着疾病严重程度的增加，发现cMono的表型转变为较低的HLA-DR、CD33和CD11c的表达，存在增殖性单核细胞，这与脓毒症患者的变化类似。与重症/危重新冠肺炎患者相比，脓毒症pDC和CD33lowcDC2水平较低（图4A-C）。与健康志愿者相比，新冠肺炎危重病例、流感和脓毒症患者中的周期类群和抗氧化性金属硫蛋白基因高表达的类群显著增加。利用单细胞ATAC seq分析染色质的可及性，发现可及性差异最大的染色质峰相关基因包括STK24和FGFRL1。DNA结合motifs最显著富集于AP-1、SW1/SNF和Bach转录因子家族成员（图4E）。与健康志愿者相比，新冠肺炎患者髓样细胞中包含FOS和JUN motifs的基因组区域可及性更高，这一信号在恢复期也可以看到（图4F）。
Fig.4 髓样细胞和淋巴细胞亚群的变化与新冠肺炎严重程度有关
· 新冠肺炎的严重程度与特异的T和NK细胞群以及与细胞周期、氧化还原状态和衰竭相关的特征相关
在所有新冠肺炎患者组中，活化的CD4+和CD8+T细胞的频率都有所增加，并在恢复期保持高水平。CD27+的活化CD4+T细胞比例高于脓毒症患者，而CD56+细胞毒性CD8+T细胞比例降低（图4A）。虽然在急性新冠肺炎患者中活化的CD4+T细胞中有激活、增殖和耗竭marker的表达，但随着疾病严重程度的增加，CD8+T细胞中这些marker增加（图4G）。随着新冠肺炎严重程度的增加，类先天淋巴细胞群发生变化，包括MAIT细胞，表现出一种涉及细胞激活严重程度的变化梯度（图4H）。
· 重症新冠肺炎与未突变B细胞的克隆性增殖和自身反应性B细胞的激活有关
接下来，研究者利用bulk VDJ测序来研究全血中B细胞的免疫组库。在健康志愿者中，克隆性扩张在记忆B细胞群体中占主导地位。而在新冠肺炎和脓毒症患者中，浆母细胞扩张，严重和显著危重的新冠肺炎患者也在记忆群体中存在克隆。浆母细胞的克隆性扩张具有统计学意义，并且与新冠肺炎严重程度相关，而脓毒症则没有显著变化（图5B）。新冠肺炎患者幼稚B细胞和浆母细胞之间存在分化方向，与脓毒症患者不同，并与新冠肺炎以滤泡外B细胞为主的反应一致（图5D）。接下来，研究者测试了靶向自身抗原和红细胞抗原的B细胞是否与新冠肺炎有关，发现自身反应性IGHV4-34BCR在IGHD/M中显著耗尽，但在类转换B细胞中升高，最显著的是IGHA2和IGHG2 B细胞（图5E），与这些自身反应性B细胞在对SARS-CoV-2的反应中的类别转换一致。在脓毒症病例中，没有观察到IGHV4-34自身反应性BCR水平或类别转换的明显差异。上述结果表明，重症新冠肺炎患者的浆母细胞扩张包括高水平的广泛自身反应性B细胞，这与B细胞驱动的免疫病理的新作用相一致。
Fig.5 B和T细胞免疫组库的差异与新冠肺炎严重程度相关
· CD8+T细胞群体免疫组库多样性降低
研究者分析新冠肺炎和T细胞克隆性之间的关系发现在考虑年龄的情况下，重症和危重新冠肺炎患者中CD8+T 效应记忆、CD8+ T中央记忆和 MAIT 细胞多样性降低，脓毒症也有类似的变化。在住院患者中，随着疾病严重程度的增加，含有TCR的CD8+T效应记忆细胞的比例较低（图5J）。危重患者的SARS-CoV-2反应性细胞未能扩张为效应表型，或者扩张的细胞可能有明显的重新分布。CD8+T效应记忆细胞在危重疾病中的新冠肺炎克隆型相对耗竭（图5M）。
· 新冠肺炎血浆蛋白质组揭示严重程度和疾病特异性的相关性涉及急性期蛋白、代谢过程和组织损伤的标志物低
作为对多组学研究的补充，研究者使用LC-MS/MS 技术研究血浆蛋白组特征，并发现了严重程度和病因的差异。严重疾病与急性期蛋白、补体系统蛋白、补体膜攻击复合体成分和与功能相关的蛋白质家族上调有关（图6A和B）。通过蛋白质互作网络分析对蛋白质进行聚类分析发现一个大类群，富集于包含胆固醇运输和纤维蛋白血栓的生物学过程。两个较小的富集于细胞溶解和补体激活的类群与疾病严重程度呈正相关（图6C）。与样品间差异主要相关的过程有急性期反应和炎症、代谢和胆固醇运输。轻度住院的新冠肺炎患者在类维生素A、胆固醇、脂蛋白和脂溶维生素的囊泡运输和代谢过程上与健康志愿者不同；而社区患者的补体激活和凝血水平更高。将重症和脓毒症患者进行比较发现了19个蛋白显示出新冠肺炎特有的变化，表现为急性期反应增强、补体活化和受体介导的内吞作用。
· 血浆细胞因子和趋化因子图谱显示炎症介质参与的证据
为了表征SARS-CoV-2应答的炎症介质，研究者使用Luminex分析了51个循环细胞因子和趋化因子蛋白。结果表明，与健康志愿者相比，49%新冠肺炎患者的血浆中分析物含量丰度不同，其中其中CCL2、CCL19等上调表达的因子与住院新冠肺炎患者病情严重程度密切相关（图6D）。进一步与脓毒症和流感进行比较，发现重症/危重新冠肺炎患者血浆G-CSF、IL-8、TNF等蛋白水平水平低于脓毒症（图6E）。使用蛋白质—临床特征分析解析新冠肺炎严重程度发现临床特征与GM-CSF、CXCL10和TREM-1等蛋白质存在强烈相关性（图6F）。
Fig.6 新冠肺炎的血浆蛋白质特征及其亚表型
· 血浆蛋白质组变异鉴定不同疾病严重程度的患者亚型
利用SNF整合LC-MS/MS 和 Luminex数据，通过对疾病严重程度分析（吸入氧浓度和SOFA氧气评分）发现了两个分离的类群，并鉴定到11个蛋白质作为分类的主要判别特征（图6G）。当比较这两个类群时发现类群2与较高的28天死亡率相关（图6H）。在另一个利用Olink蛋白检测技术的队列中进行验证发现，利用11个预测蛋白质中的7个确定了2个最佳类群，这些与疾病严重程度有明确关系（图6I），区分新冠肺炎和脓毒症的特征包括在脓毒症中升高的LCN2和CCL20，以及在新冠肺炎中升高的CXCL10、APCs和FN1。
· 有监督机器学习鉴定预测疾病严重程度的蛋白质biomarkers
使用机器学习将两种蛋白质组学数据和全血全转录组测序整合分析，确定了实验类型特异性的方差信息成分，以降低训练样品集的维度，然后确定哪些信息最丰富，哪些基因/蛋白质对每个成分的贡献最大（图7A）。分析结果表明，急性期蛋白SAA2和CRP、IGHG4、趋化因子(CCL20和CCL2)、IL-6和补体成分C5a可预测严重程度，在hold-out验证集中验证这些特征的综合表现，预测WHO类别组的平衡准确率为75%-80%（图7B）。此外，还在住院新冠肺炎患者和脓毒症患者中筛选特征，结果鉴定到81个特征，确定了特异的差异表达基因、蛋白质和显著富集的一些通路包括造血细胞谱系和肾素-血管紧张素系统。
· 新冠肺炎严重性和特异性的综合标志
利用SDA算法，从细胞组成、基因表达和血浆蛋白质组学角度入手，对152个样品进行分析，发现了381个潜在的SDA成分（图7C和D）。其中成分171与新冠肺炎严重程度最相关，该成分的高特征贡献来自血浆蛋白质，包括升高的血浆趋化因子（趋化和激活、GM-SCF以及急性期激活蛋白、LRG1和LBP）、丰度降低的中间单核细胞、高表达的细胞应激伴侣CLU和甲基转移酶 METTL7B、下调表达的IgE受体和多个HLA II类基因，以及抗原呈递、TCR 信号传导和哮喘的通路富集（图7E）。进一步分析发现于健康志愿者相比，有130个SDA成分与新冠肺炎有关。与轻、重度但非危重疾病相关的成分包括成分256(干扰素反应基因上调，过氧化氢酶和细胞色素c氧化酶等基因下调，该成分是新冠肺炎患者特有的）和成分42（图7F）。这种方法还发现了另一个新冠肺炎特有的成分187，它在住院和社区新冠肺炎患者中的NK、B和T细胞中具有高负荷分数（图7G）。此外，研究者还鉴定到新冠肺炎和流感相关的成分，包括广泛上调的免疫球蛋白heavy/kappa/lambda基因、JCHAIN、与可能的抗体依赖的细胞毒性有关的MZB1(成分6)；以及显著上调干扰素途径基因(成分235)。（图7H和I）。总体而言，潜在成分分析确定了关于脓毒症和流感的新冠肺炎严重程度和特异性的特征。研究者发现了关键的细胞群体如增殖的单核细胞和浆母细胞，以及从干扰素信号到骨髓生成、免疫球蛋白产生和应激激活反应信号的固有和适应性机制的特征。
Fig.7 综合性方法分析定义新冠肺炎反应的标志
主要结论：
本研究构建了一个关于不同新冠肺炎疾病程度的综合型多组学血液图谱，并与流感、脓毒症患者和健康志愿者进行比较，鉴定到免疫特征和宿主反应的相关因素。疾病严重程度的特征涉及细胞、它们的炎症介质和网络，包括祖细胞和特定的髓样和淋巴细胞亚群，免疫组库的特征，急性期反应，代谢和凝血。持续的免疫激活涉及AP-1/p38MAPK，这是新冠肺炎的一个特征。血浆蛋白质组能够对患者群进行亚表型分型，并能预测病情严重程度和预后。基于系统的综合分析显示，与流感和脓毒症相比，特征分组与严重性和特异性有关。综上所述，研究者使用的方法和构建的血液图谱将有助于未来的药物开发、临床试验设计和新冠肺炎的个性化用药方法。
参考文献：
A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks ofdisease severity and specificity. Cell vol. 185,5 (2022): 916-938.e58
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