题目：Development and Clinical Validation of a Novel 4-Gene Prognostic Signature Predicting Survival in Colorectal Cancer

摘要：

在这项研究中，我们收集了与能量代谢有关的基因，使用公共数据库中的基因表达数据根据与能量代谢有关的基因对结肠癌（COAD）的分子亚型进行分类，并进一步评估了分子亚型与预后和临床特征。
分子亚型的差异表达分析产生了1948个差异表达基因（DEG），其功能与癌症的发生和发展密切相关。
基于DEG，我们构建了一个4基因的预后风险模型，并将FOXD4，ENPEP，HOXC6和ALOX15B的高表达确定为与发生COAD的高风险因素。
4-基因签名不仅在早期COAD患者中而且在所有结肠癌患者中，都在来自不同平台的数据集中具有强的稳健性和稳定的预测性能。
通过GSEA获得的高风险和低风险组与结肠癌的发生和发展显着相关的富集途径。此外，qPCR，免疫组织化学染色和Western印迹分析的结果表明，FOXD4，ENPEP，HOXC6和ALOX15B在CRC组织和细胞中过度表达。这些结果表明，签名可以潜在地用作临床诊断的预后标记。

流程图

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结果解读

能量代谢有关的基因来源

从Reactome（https://reactome.org/）下载与人类代谢相关的途径，并从11种代谢途径中整理出了与能量代谢相关的594个基因

基于能量代谢基因的分子分型

使用NMF算法识别分子亚型。选择最佳聚类数4（图1A）。四个亚型的能量代谢相关基因表达（图1B)。四个亚型的预后，结果显示，C1和C4的预后最差，C2的预后更好，并且这4个亚型的预后显着不同（图1C）。此外，作者根据不同亚型计算了基因突变的比例，从每个亚型中选择了突变率最高的前20个基因，并获得了45个基因突变，这表明频率最高的基因突变之间存在很大差异。四个亚型。每种亚型的45个基因突变均显示在（图1D)，根据45个基因突变的频率差异显示各种亚型。每种亚型在基因突变频率上都有一定差异。

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然后比较了分子亚型的临床特征（表3）。与能量代谢有关的基因集将COAD为为四个亚型。作者比较了这四种亚型在T分期，分期，性别和年龄方面的临床特征差异，但未观察到显着差异（补充图2）。此外，使用TIMER（肿瘤免疫估计资源）工具，作者比较了四种亚型的免疫评分。在C2亚型中发现的五个免疫细胞（B细胞，CD8 T细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞）的得分均低于C1，C3和C4亚型（[图2]），而C1样本的免疫细胞分数均明显高于其他亚型。这一发现可能表明COAD患者的免疫侵袭与预后之间存在复杂的关系。所有样品的六个免疫细胞的得分数据显示在补充表5中。

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亚型间差异表达基因的分析

首先鉴定了差异表达的基因。DESeq2用于计算预后最好的C2和C1 / C3 / C4分子亚型之间的差异表达基因（DEG）。鉴定了两组共有2459个差异表达基因（padj。<0.05和| log2FC |> 1），并去除了1,948个基因以实现冗余。图中显示了上调和下调的差异表达基因（C2〜C1，C2〜C3和C2〜C4）的火山图。图3A–C。如图所示，C2和C1亚型之间差异性下调的基因是多余的和上调的，在C2和C3亚型以及C2和C4亚型之间主要差异表达的基因中，上调的较少，而下调的更多。差异表达的基因见补充表6。 image007.png

然后，作者对差异表达的基因进行了功能分析。此外，使用R包clusterProfiler和选定的p <0.05阈值对这1948个DEG进行了KEGG和GO功能富集分析。结果示于补充表7,8，8。DEG富含69条KEGG途径和1109个GO项。前20个GO术语显示在[图4A]包括血管生成，白细胞迁移和上皮细胞增殖的正向调节。前20条富集途径显示在[图4B]，最重要的途径是糖尿病并发症中的PI3K-Akt信号传导途径，钙信号传导途径，AGE-RAGE信号传导途径和其他与癌症相关的途径。

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基于DEG的预后风险模型的构建

首先，使用训练集构建风险模型。根据上述方法，作者获得了训练集样本（如表2），其中总共包含26个具有明显预后差异的基因（补充表10）。此外，使用randomForestSRC R软件包进行功能选择。作者鉴定了相对重要性>0.65的基因作为最终特征。图5A 显示错误率与分类树数量之间的关系，并且 图5B 显示了前四个基因的重要度顺序。

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然后，作者建立了一个多因素回归模型进行预后评估。对从随机森林算法获得的四个基因进行了多元回归分析，其中显示了四个基因的系数，HR，置信区间，Z得分和实物估计的重要性和相对重要性。表4然后，建立了一个4基因签名，模型如下：

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然后，对风险模型进行了ROC分析。计算每个样本的风险评分的表达水平，并绘制样本的RiskScore分布。如图所示图6A与低风险评分相比，从OS图表中可以看到高风险评分，这表明具有高RiskScores的样本的预后较差。在不同的样品中，FOXD4，ENPEP，HOXC6和ALOX15B的基因表达变化增加了风险值，因此，这些基因的高表达被确定为危险因素。此外，作者使用R软件包timeROC对RiskScore的预后分类进行了ROC分析。分析了1年，3年和5年的预后预测的分类效率，如下所示图6B。可以看出，该模型具有较高的AUC离线面积，AUC高于0.8，三年预测的AUC离线面积达到0.95。基于3年预测的AUC值将样本组的Gordon指数计算为临界值（2.563985），发现样本明显分为高风险和低风险组。绘制了KM曲线（如图6C），两组之间的差异显着（p <0.0001）。
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内部和外部数据集验证了4基因签名的稳健性

首先，使用内部数据集来验证4基因签名的稳健性。如图所示图7A，对于1年和3年预测，模型具有较高的AUC离线区域，而5年预测的AUC高于0.65。同样，根据一年预测的AUC值，使用戈登指数计算了样本组的临界值（1.751732），将样本分为高风险和低风险组，并绘制了KM曲线，显示在图7B。可以看出，它们之间存在显着的差异，p = 0.0086。

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此外，使用了与训练集中相同的模型和相同的系数来计算427例结肠癌TCGA样本中的风险评分。结果显示在图7C，表明模型的AUC线面积大于0.6。类似地，作者根据AUC值使用样本组的戈登指数计算出临界值（1.232182），将样本分为高风险和低风险组，并绘制了KM曲线，如图图7D。可以看出，两组之间存在显着的差异（p <0.0001）。

最后，作者使用外部数据集验证了4基因签名的稳健性。在一组GEO数据集中采用了与训练集中相同的模型和相同的系数。如图所示图8A，该模型的年度AUC高于0.67。同样，根据1年预测的AUC值，使用戈登指数计算了样本组的临界值（5.989193），将样本分为高风险和低风险组，并绘制了KM曲线，如图所示图8B。可以看出，两组之间存在显着差异（p = 0.034）。

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此外，使用与训练集中相同的模型和系数来计算573例结肠癌样本中的风险评分。如图所示图8C，则该模型对一年期预测的AUC离线区域大于0.62。同样，根据一年预测的AUC值，使用戈登指数计算了样本组的临界值（5.53358），将样本分为高风险和低风险组，并绘制了KM曲线，如图所示图8D。可以看出，两组之间的差异很小（p = 0.053）。

风险模型和临床特征分析

评估风险模型的预测准确性与临床特征的预测准确性之间的关系（表5），作者从单因素和多因素的角度分析了年龄，性别，阶段，T阶段和RiskScore之间的预测关系。最终结果显示在补充表9中。 image021.png

临床特征包括年龄，性别，分期，T期和RiskScore被用于构建列线图模型，如图 图9A。此外，通过ROC分析评估了诺模图的预测准确性，结果表明，对于1年，3年和5年预测，诺模图的AUC分别为0.98、0.85和0.86（图9B）。 图9C 展示了3年列线图模型与理想模型之间的比较，结果表明3年列线图模型的一些指标与理想模型的指标基本一致，这表明模型的准确性相对较高。

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GSEA揭示了高风险人群和低风险人群中丰富的途径 image025.png

GSEA被用于342例TCGA培训案例中，以分析高风险组和低风险组中显着丰富的途径。选择的基因集是c2.cp.Kegg。GSEA输入文件包含由TCGA训练集和4基因签名的样本标签标准化的表达谱数据。样品标签将样品标记为属于高风险组或低风险组。富集途径的阈值为p <0.05，并且所获得的显着富集途径示于补充表10中。

例如，高风险组的B细胞受体信号传导途径，JAK STAT信号传导途径，小细胞肺癌等途径明显丰富。 图10。

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