作者，追风少年i
hello，周四了，7月即将结束，不知道大家感觉怎么样，时间匆匆，从不停留，我们只好继续单细胞空间的分析了。
今天的分析内容在文章Single-cell roadmap of human gonadal development，2022年5月发表于nature，影响力很高了，首次构建出人类性腺发育的细胞图谱，鉴定出参与人类性别决定的细胞类型。我们来分享一下
性腺在人类发育中起着关键作用。在成熟为女性的卵巢或男性的睾丸之前，它们决定了生物性别，产生生殖所需的卵子和精子。
发育的早期几周是非常动态的，这一过程中伴随着细胞类型迅速出现和消失。这使得研究导致性别决定和随后分化为睾丸或卵巢特异性细胞的事件具有挑战性。虽然我们对性腺发育的大部分知识来自于小鼠研究，但不确定这些知识有多少能真正转化为人类。
单细胞技术和空间技术的结合使得这些作者不仅能够确定哪些基因在单个细胞中表达，而且还能了解组织内不同细胞类型的排列以及细胞之间如何对话。这是破译发育中的配子在性腺内成熟成为精子或卵子时如何与相邻细胞相互作用的关键。
摘要
性腺发育是一个复杂的过程，涉及性别决定，然后是分化成熟为睾丸或卵巢。从历史上看，有限的组织可及性、缺乏可靠的体外模型以及人类和小鼠之间的关键差异阻碍了对人类性腺发生的了解，尽管它在性腺疾病和不孕症中很重要。在这里，使用单细胞和空间转录组学、染色质可及性分析和荧光显微镜相结合，生成了孕早期和孕中期人类性腺的综合图。通过分析小鼠的等效发育阶段，提取了控制种系和体细胞谱系发育的人类特异性调节程序。在这两个物种中，定义了性别规范时存在的体细胞状态，包括在雄性中上调睾丸决定因子 SRY 和 sPAX8s（位于性腺-中肾界面的性腺谱系）的双能早期支持群体。在女性中，解决了产生第一波和第二波颗粒细胞的细胞和分子事件，这些细胞将发育中的卵巢区分开来调节生殖细胞分化。在男性中，识别出人类 SIGLEC15+ 和 TREM2+ 胎儿睾丸巨噬细胞，它们分别向发育中的睾丸索内外的体细胞发出信号。该研究提供了人类和小鼠性腺分化的综合时空图，可以指导体外性腺发生。
正文
在人类中，出现在中肾腹面的未分化的双能性腺决定了卵巢或睾丸的命运。 受孕后约 6 周（受孕后周；PCW），表达 Y 连锁睾丸决定因子 SRY 的性腺体细胞分化为支持细胞（睾丸支持细胞），或在缺乏时分化为颗粒前细胞（preGCs；卵巢支持细胞）。 睾丸支持细胞和 preGCs 协调剩余的性别特异性性腺体细胞（例如，间质）和生殖细胞谱系的分化。 在雄性中，配子前体原始生殖细胞 (PGC) 分化为前精原细胞，与支持细胞形成索状结构并进入有丝分裂停滞。 在女性中，PGCs 分化为卵原细胞，卵原细胞进入从有丝分裂到减数分裂的异步过渡。 在发育后期，颗粒细胞围绕初级卵母细胞形成原始卵泡，在青春期之前保持静止。
在这里，使用单细胞多组学和空间方法来解开在空间和时间上介导人类性腺发育的细胞和分子程序。 发现了体细胞谱系中以前未表征的细胞异质性，这与在发育过程中起源的性腺状况有关，例如性发育的差异。 此外，生成了小鼠单细胞转录组学数据，以将人类发现与小鼠对应物联系起来，促进这些物种之间的转化研究。
Human–mouse gonadal atlas
分析了妊娠早期和中期（6-21 PCW）的人类性腺和邻近的性腺外组织，涵盖了性别决定和分化为卵巢和睾丸的阶段（女性 n = 33，男性 n = 22）。使用了几种单细胞基因组学方法：（1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）； (2) 单细胞可及染色质测序 (scATAC-seq) 和 (3) 结合单核 RNA 和 ATAC 测序 (snRNA-seq/scATAC-seq) 分别对 347,709、96,174 和 40,742 个细胞进行分析。还在性别决定时间（即胚胎期（E）10.5、11.5 和 12.5（63,929 个细胞））生成了相应小鼠组织的单细胞转录组，并将它们与先前发表的涵盖妊娠后期的数据集整合在一起。分别分析男性和女性样本，并根据已知标记的表达和从 scRNA-seq 到 scATAC-seq 的标签转移分配细胞注释。研究中分析的细胞样本能够解决新的体细胞状态，这在之前的人类性腺 scRNA-seq 研究中没有定义。
为了在特定组织中定位细胞， (1) 使用 Visium 和多路复用单分子荧光原位杂交 (smFISH) 生成空间转录组学数据，以及 (2) 通过显微切割分离性腺和性腺外组织以分别进行分析。 Germ (DAZL+) 和支持 (GATA4+, WNT6+) 细胞仅存在于性腺内，而其他细胞类型，包括体腔上皮 (UPK3B+) 和间充质 (PDGFRA+) 细胞，同时存在于性腺和中肾（腺外组织）中 . 在人和小鼠中，转录因子 (TF) GATA4、LHX9 和 ARX 的表达是性腺体腔上皮和间充质细胞的标志，而 GATA2 的表达仅限于中肾和其他性腺外组织。
使用在人类细胞上训练的支持向量机 (SVM) 分类器，发现人类和小鼠原代细胞谱系的转录组特征之间存在很强的对应关系。 具有低相似性（median prediction probability < 0.4）的显著例外是两性的早期支持和性腺间充质谱系，以及雌性的颗粒前细胞，这表明人类和小鼠之间体细胞谱系的发育存在差异。
Human–mouse harmonized single-cell atlases of gonadal and extragonadal tissue
- 注：a, Schematic illustration of gonadal development showing the main structures of the XX and XY gonads. b, Diagram summarizing the stage and sex composition of our sample cohort along with main events occurring during gonadogenesis. c, Top shows the UMAP of cell lineages (colour) in the human female scRNA-seq (n = 213,898), human female scATAC-seq (n = 84,631) and mouse female scRNA-seq (n = 70,379) datasets. Bottom shows UMAP projections of cell lineages (colour) in the human male scRNA-seq (n = 133,811), human male scATAC-seq (n = 52,285) and mouse male scRNA-seq (n = 32,889) datasets. Clusters for mesothelial, supporting and gonadal mesenchymal LHX9+ cells were defined in an independent per-lineage reanalysis and projected onto this dataset. Dashed lines outline the cell populations unique to the gonads. Doublets and low-quality control cells were removed. CoelEpi, coelomic epithelium; Endo, endothelial; Epi, epithelial; F. Leydig, fetal Leydig; Gi, gonadal interstitial; Mesen, mesenchymal; Oi, ovarian interstitial; OSE, ovarian surface epithelium; preGC, pregranulosa cells; PV, perivascular; sPAX8, supporting PAX8 +; Ti, testicular interstitial; SMC, smooth muscle cell.
Quality control of scRNA-seq data of the human developing ovaries and testes
Analysis of the chromatin accessibility landscape of the human developing ovaries and testes
Gonadal and extragonadal location of mesenchymal and mesothelial cells
TFs modulating germ cell differentiation
PGC 在大约 3-5 PCW 时colonize人类性腺，并在雄性和雌性支持细胞的引导下，在大约 6 PCW 时开始分化为前精原细胞或oogonia。为了比较人类生殖细胞与其他哺乳动物的分化，将人类和小鼠性腺生殖细胞与更多来自小鼠和猕猴的 scRNA-seq 性腺生殖细胞数据集进行了整合。使用轨迹重建方法来追踪人类 PGC 分化为前精原细胞和卵母细胞，并研究了介导这些转变的 TF 程序。使用转录组和开放染色质数据优先考虑那些在人类中差异表达和活跃的 TF，并比较了它们在人类、猕猴和小鼠之间的表达动态。将 GATA4 鉴定为在 PGC 中上调的灵长类动物特异性 TF。在所有分析的物种中，发现 SOX4 在 PGCs 和 prespermatogonia 中是活跃的，但在卵子发生过程中被下调。此外，从 PGC 到前精原细胞的转变涉及 EGR4、KLF6 和 KLF7 的激活。胎儿卵母细胞的分化比其男性对应物更复杂：它涉及减数分裂起始和空间轨迹，PGCs 仅限于外皮层，细胞在分化时向髓质迁移。在减数分裂开始之前，与减数分裂前的 STRA8 激增一致，分析发现 ZGLP1 的激活，这是最近在小鼠中描述的卵源性 TF。在这个减数分裂前阶段，人类卵原细胞也会上调 ZIC1 因子，该因子参与减数分裂诱导所必需的视黄酸产生。进入减数分裂后，卵原细胞激活先前在小鼠中描述的 DMRTC2 和 ZNF711，以及在猕猴和小鼠卵原细胞中类似上调的另一个 DMRT 成员 DMRTB1。此外，在不同的卵原细胞阶段，HOX 因子（例如，HOXA3、HOXD8）和辅助因子（例如，PBX3）上调。在卵母细胞中，发现 TP63 和 ZHX3 的激活，在猕猴和小鼠中具有保守的表达动力学。
Characterisation of germ cell states
Cross species TF comparison of germ cells
Somatic cells during sex determination
性腺嵴中的体腔上皮是性腺体细胞的主要来源。 使用轨迹推断方法，确定了双能早期支持性腺细胞 (ESGC)，将 GATA4+ 体腔上皮与支持细胞或人类和小鼠的first wave preGC (preGC-I) 连接起来。 ESGCs 在早期性腺中短暂出现（人类大约为 6-8 个 PCW，小鼠为 E11.5），并且在雄性中，是第一个表达睾丸决定因子 SRY 的性腺体细胞，这是支持细胞定型所必需的。 因此，ESGC 是在早期性腺中产生性别特异性支持细胞的双能前体。
将人类和小鼠之间具有保守表达动力学的一组核心基因确定为 GATA4+ 体腔上皮细胞，它们分化成first wave支持细胞。 在人类中，体腔上皮和 ESGC 通过早期体细胞群连接，该细胞群下调间皮标志物（UPK3B-、LRRN4-）、上调支持谱系标志物（WNT6+）并与未分化的性腺间质（Gi）细胞（ARX+、TCF21+）共享 TF 。 接下来，人类和小鼠 ESGC 下调 LHX9 和间质 TF（ARX-，TCF21-），同时进一步上调支持谱系标记 WNT6。 ESGC 还上调 GPR37 和 DMRT1，后者对睾丸发育至关重要。 男性 ESGCs 是 SRY+，并启动了前卵巢 RSPO1/WNT4-β-catenin 通路的下调。因此，在这个阶段的女性 ESGCs 中已经可以检测到对卵巢命运至关重要的 FOXL2 的表达。
人类 ESGC 上调干细胞标志物（LGR5+、TSPAN8+）。 LGR5 在人和小鼠之间表现出不同的表达模式：在人类中，LGR5 对 ESGC 具有特异性； 在小鼠中，Lgr5 在颗粒前体和支持细胞形成的second wave期间上调，在 ESGC 中具有基础表达。 仅在人类 ESGC 中检测到 TSPAN8 的表达。 人类雌性 ESGC 也上调 OSR1，这是 preGC-I 的特征，在小鼠中明显不存在。 使用这些标记的组合，通过多重 smFISH 在发育中的人类睾丸和卵巢中定位 ESGC。 在 8 PCW 早期，ESGCs (TSPAN8+, LGR5+) 与女性的 preGC-I (OSR1+) 一起存在于卵巢髓质中，或者男性的发育中的睾丸索与早期支持细胞 (SOX9+, LGR5-) 一起存在。
New gonadal somatic cells during sex determination in humans and mice
- 注：a, UMAP of somatic cell states (colour) in the human scRNA-seq (n = 191,230), human scATAC-seq (n = 74,592) and mouse scRNA-seq (n = 45,468) datasets. Doublets and low-quality control cells were removed. b, Dot plots show the variance-scaled, log-transformed expression of genes (x-axis) characteristic of the first wave of somatic cells (y-axis) in humans and mice. c, UMAP of somatic cells overlaid with RNA velocity maps in two humans (7 PCW testis; 7.5 PCW ovary) and two mice (E11.5 testis, E12.5 ovary) gonadal samples, analysed independently. d, Relative proportions of human and mouse somatic cell states (colour) profiled with scRNA-seq, classified by sex and developmental stage. Black arrows highlight the ESGCs. e, Dot plot showing the variance-scaled, log-transformed expression of human-specific early somatic and ESGC markers (x-axis) in the first wave of human supporting cells (y-axis). CoelEpi, coelomic epithelium; Gi, gonadal interstitial; Oi, ovarian interstitial; preGC, pregranulosa cells; sPAX8, supporting PAX8; Ti, testicular interstitial.
Human-mouse comparison and trajectory inference of early gonadal somatic cells
PAX8+ cells define gonadal boundaries
性腺-中肾界面是早期性腺发生过程中广泛组织重塑的部位，调节细胞迁移、血管化和睾丸网的形成，睾丸网是连接睾丸索和生殖管的小管网络。 分析定义了表达性腺（GATA4+、LHX9+ 和 NR5A1+）和支持（WNT6+）标记的支持样 PAX8+ population (sPAX8s)，这种标记与人类和小鼠的first wave支持细胞一起出现。 如 Visium 所示，sPAX8s 位于睾丸中将形成睾丸网的部位，与苗勒管和沃尔夫管中的上皮细胞明显不同，如上皮标志物（EPCAMlow，KRT19low）的低表达所示， 用上皮细胞分析时它们的单独聚类在一起。
对涵盖广泛发育时间点（window）的人类样本的深入分析能够区分人类中的两个 sPAX8 子集：早期和晚期 sPAX8。 早期的 sPAX8s 是两性中大约 6-8 PCW 富集的性未分化细胞。 用 smFISH 对性腺进行染色表明早期的 sPAX8（PAX8 +，EPCAMlow）存在于性腺内部，在性腺-中肾界面处，直到 8 PCW（CS17 到 CS20）。 还在小鼠的类似位置发现了这一群体。 晚期 sPAX8s (PAX8+, EPCAMlow) 仅存在于 8 PCW 晚期的男性中。 smFISH 分析在睾丸网发育的睾丸索的两极检测到 sPAX8，与 Visium 数据一致。 在 8 PCW 后发育的人类卵巢中，仅在肝门附近发现了少数 sPAX8，这与在后期退化的基本卵巢网的存在相一致.
两个 sPAX8 子集都显示出独特的轴突引导因子转录模式，表明它们具有结构和支持作用。 在人类样本中，早期的 sPAX8s 表达 CXCL14，其受体 CXCR4 由内皮细胞和支持细胞表达，这表明这些群体具有趋化作用。 雄性晚期 sPAX8s 表达 NRP2，即 VEGF 和 SEMA3B/C 的受体，它们被上皮细胞上调。 sPAX8s 独特地表达生长抑素 (SST) 和 IGFBP3，其受体在各种细胞中上调，包括支持细胞、上皮细胞、内皮细胞和体腔上皮细胞。 总之，这些数据表明，sPAX8s 是哺乳动物中的一种性腺支持样细胞谱系，可介导睾丸网和卵巢网的形成。
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Gonadal supporting PAX8+ cells define gonadal boundaries
The second wave of pregranulosa cells（前颗粒细胞）
在小鼠卵巢中，体腔上皮细胞分化为卵巢表面上皮细胞并启动second wave皮质前颗粒细胞，独立于 RSPO1/WNT4-β-连环蛋白信号传导。 在人类样本中，还定义了在 8 PCW 之后出现的second wave颗粒细胞 (preGC-IIa/b)，下调 RSPO1/WNT4 并形成从外部 (preGC-IIa) 到内部皮质的梯度。 PreGC-IIa 与 OSE（UPK3B+、LHX2+、IRX3+）共同出现在空间（外皮层）和时间（中间 8 PCW）中，并表达视黄酸抑制剂 CYP26B1（减数分裂抑制剂）以及少量的 FOXL2。 PreGC-IIb 出现在 11 PCW，并上调 FOXL2 和 BMP2。 在大约 17 PCW 时，内皮层出现表达卵泡发生标志物（NOTCH3+、HEYL+）和视黄醇脱氢酶（RDH10+）的发育中的颗粒细胞。 随着卵巢的发育，first wave前颗粒（preGC-I）仅限于髓质。
尽管跨物种的 preGCs 之间存在时空相似性，但使用 SVM 分类器将人类singature投影到小鼠对应物上显示出不同的转录组程序。将转录组学与染色质可及性相结合，以确定调节granulosa waves的 TF 在人类中。因此，发现人类和猕猴之间的 TF 模块保存完好，但在小鼠中表现出本质差异。OSE 激活了灵长类动物特异性 TF LHX2，它在 preGC-IIa 中保持活跃。随着它们的分化，preGC-IIb 细胞上调 FOXL2 并表达 WNT 诱导的 TFs (HIF1A+, FOXO1+, FOXP1+)，这是髓质 preGC-Is 共有的一个程序，表明卵巢深处存在更高的 WNT 环境。在灵长类动物中发育的颗粒细胞上调类固醇激素受体 NR1H4 和发育因子 PBX3。
为了研究不同皮质和髓质微环境中的人类前颗粒细胞如何影响生殖细胞分化，将 CellPhoneDB 数据库扩展到 (1) 包括非肽配体和 (2) 将受体与其下游 TF（CellSign 模块）连接起来。 PreGC-IIa 细胞存在于卵巢外皮层，表达趋化因子（例如 NRG1）和生存因子（例如 KITLG），而 KIT 下游的 STAT3 在 PGC 中具有活性。 PreGC-IIb 细胞位于内皮层，表达参与减数分裂起始的配体（例如 ALDH1A1 的视黄酸）和卵子发生（例如 BMP2）以支持 PGC 分化。在髓质中，preGC-Is 上调参与雌激素产生的酶（HSD17B6 和 CYP19A1）。在大约 17 PCW 时，preGC-IIb 细胞分化成发育中的颗粒细胞，这些细胞围绕卵母细胞介导卵泡形成和/或调节卵母细胞存活。我们发现了卵泡中细胞外基质蛋白的独特组成，以及用于介导成功的卵泡组装的新颗粒-卵母细胞相互作用候选物。一个例子是 netrin-1 (NTN1) 及其受体 DCC，它们参与轴突引导、细胞迁移和凋亡。
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Second wave of fetal pre-granulosa
Two testis-specific resident macrophages
组织驻留巨噬细胞在小鼠睾丸发育和功能中起作用。为了在人类样本中全面表征它们，使用泛白细胞标记 CD45 对 11 个样本中的细胞进行分类，并将它们与主要分析中的免疫细胞整合。使用 scRNA-seq 定义了两个睾丸特异性巨噬细胞群，并使用 smFISH 对其进行了验证：(1) 具有破骨细胞样特征 (SIGLEC15、ACP5、ATP6V0D2) 的 SIGLEC15+ 胎儿睾丸巨噬细胞 (ftMs) 和 (2) TREM2+ ftMs，具有小胶质细胞样特征（TREM2、P2RY12、SALL1）。与所有发育中组织的组织修复巨噬细胞特征相比，SIGLEC15+ 和 TREM2+ ftM 是罕见的群体（2.8% SIGLEC15+ ftM，5% TREM2+ ftM，92.2% 组织修复巨噬细胞）。使用 SVM 将其他发育器官中骨髓细胞的 scRNA-seq 数据集整合和投影到性腺免疫歧管上，验证了 SIGLEC15+ ftMs 和破骨细胞之间以及 TREM2+ ftMs 和小胶质细胞之间的共享转录组学特征。
在结构性腺标志物的帮助下，smFISH 成像在间质空间（PDGFRA+ 或 NR2F2+）中定位组织修复巨噬细胞（CD68+、F13A1+）和 SIGLEC15+ ftMs（CD68+、SIGLEC15+）。 SIGLEC15+ ftMs 接近睾丸中的内皮细胞 (CDH5+) 并表达 COL1A2，它可能与内皮细胞和间充质细胞表达的整合素 (α1/β1、α2/β1、α10/β1 和 α11/β1) 相互作用。 SIGLEC15+ ftMs 也表达重塑分子 MMP9，并且它们的数量在发育的后期减少，表明在促进中肾内皮细胞迁移中的作用，这是睾丸索形成所需的瞬时过程（大约 8-14 PCW）。 此外，SIGLEC15+ ftMs 表达 LGALS9 和 SPP1，与这种细胞类型的潜在免疫调节作用保持一致。
TREM2+ ftMs 经常在睾丸索内发现，据预测它们通过 TREM2 和载脂蛋白（CLU、APOA1、APOE）之间的相互作用与支持细胞和生殖细胞进行交流。 TREM2+ ftM 还具有吞噬机制活性（MERTK、AXL、CYBB、BECN1、MTOR）并表达免疫调节分子（HAVCR2、ENTPD1、CD276、IL10、TREM2）。 这一结果表明 TREM2+ ftM 在去除受损或凋亡细胞方面的作用，同时最大限度地减少可能损害成熟生殖细胞的炎症和氧化应激。
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Tissue-resident macrophages in the developing testes
Macrophages smFISH panels.
Discussion
研究生成了人类和小鼠性腺发育的协调图谱，以识别新的性腺体细胞类型及其潜在的调节机制。首先，描述了 ESGC，这是一种bipotent transient population，其数量在性别决定时达到峰值，并将体腔上皮与支持细胞和first wave前颗粒细胞连接起来。因此，ESGC 是第一个在 XY 性腺中表达睾丸决定因子 SRY 的细胞，并且在人类中表达干细胞标志物，如 TSPAN8 和 LGR5。据目前所知，这些由双能支持祖细胞独特表达的标记首次在人类中得到定义。以前，WT1 和 NR5A1 用于识别小鼠中的等效种群，但研究表明这些标记物广泛表达于其他性腺体细胞。其次，围绕性别决定的开始，定义了位于性腺 - 中肾边界的先前未表征的性腺支持样种群，称之为 sPAX8s。在人类中，在 9 个 PCW 之后，sPAX8s 保留在男性发育中的索的两极，睾丸网发育，但在女性中几乎不存在。 sPAX8s 表达支持谱系的canonical markers，并且它们的独特功能很可能以前归因于其他支持细胞（即颗粒细胞或支持细胞）。第三，在人类样本中发现了第一波髓质细胞和第二波皮质前颗粒细胞，类似于小鼠。使用 CellPhoneDB ，表明由人类卵巢中不同的前颗粒细胞亚群定义的空间微环境调节生殖细胞发育。尽管人类和小鼠的时空模式相似，但某些调节程序不同。例如，小鼠第二波前颗粒细胞的特征 LGR5 仅限于人类的 ESGC。因此，LGR5 标记了小鼠和人类的不同种群，突出了对人-小鼠协调图谱的需求。第四，分别鉴定了具有破骨细胞和小胶质细胞样特征的 SIGLEC15+ 和 TREM2+ ftM。在睾丸索周围的管周空间中发现了 SIGLEC15+ ftM，这可能有助于中肾内皮细胞迁移。 TREM2+ ftMs 主要位于睾丸索内，它们可以帮助维持先前在青春期前睾丸中描述的免疫调节环境。
Methods（关注一下重点方法）
单细胞分析
- 双细胞去除---Scrublet
- 基础分析---scanpy
- 批次矫正---scVI
- 去污---SoupX
- 轨迹分析---Palantir，RNA velocities
空转数据分析
- 单细胞空间联合---cell2location（注意样本对应）
- 通讯---CellPhoneDB and CellSign
其实方法都还是那些方法，如何利用这些方法寻找生物学问题的答案，这将是一个永恒的话题
好了，已经分享给大家了，生活很好，有你更好，百度文库出现了大量抄袭我的文章，对此我深表无奈，我写的文章，别人挂上去赚钱，抄袭可耻，挂到百度文库的人更可耻
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