今天分享一篇2016年肿瘤、增强子、转录因子相关的文章，作者是美国南加州大学凯克医学院生物化学和分子医学系和诺里斯综合癌症中心的Suhn Kyong Rhie。
Rhie, Suhn Kyong et al. “Identification of activated enhancers and linked transcription factors in breast, prostate, and kidney tumors by tracing enhancer networks using epigenetic traits.” Epigenetics & chromatin vol. 9 50. 9 Nov. 2016, doi:10.1186/s13072-016-0102-4
他们研究鉴定了肿瘤特异性增强子，并揭示了参与特异性肿瘤类型和亚群增强子网络的关键转录因子。研究结果，包括大量已识别的增强子和转录因子，与乳腺癌、前列腺癌和肾癌中的这些增强子相关，将有助于理解导致这些癌症发展的增强子网络和机制。
研究结果
1、鉴别乳腺癌、前列腺癌和肾癌肿瘤组织中的差异甲基化增强子
图1 研究模型
为了定义肿瘤样本中增强子在基因组的活性区域，使用REMC和ENCODE在98个组织或细胞系中挖掘基因增强子的坐标，外加从乳腺癌、前列腺癌、肾癌的癌症细胞系和正常细胞的H3K27Ac、ChIP-seq peak中挖掘额外的基因组坐标。然后选择这些调节元件的子集，它们位于一个已知转录状态位点(TSS)的1.5 kb处，如GENCODE v19所定义的那样。我们在125个组织或细胞系中通过ENCODE Master DNaseI-seq peak或相应细胞类型的DNaseI-seq、FAIRE-seq或NOMe-seq peak相交，进一步缩小了区域。HM450阵列探针重叠狭窄的增强子区域，然后用于研究正常和肿瘤组织中的增强子活性。（图1）
图2 鉴定不同甲基化增强子区域
探针被分为四个增强子组（图2）:
- 在正常和肿瘤样本中均未甲基化(此组被称为“始终未甲基化”，代表在正常和肿瘤样本中均活性的增强子)；
- 在正常和肿瘤样本中均甲基化(此组被称为“始终甲基化”，并代表增强子在正常和肿瘤样本中均不活跃)；
- 与正常样本相比，肿瘤中的高甲基化(这组被称为“正常特异性增强子”，代表在正常样本中活跃但在肿瘤中不活 跃的增强子)；
- 与正常组织相比，肿瘤中的甲基化程度低(这一组被称为“肿瘤特异性增强子”，代表在正常组织中不活跃而在肿瘤中活跃的增强子)。
2.鉴别差异甲基化增强子的连锁基因
为了解增强子活性如何影响癌症的起始或进展，作者使用一种称为TENET的方法，将全基因组基因表达变化与增强子活性的增加或减少联系起来。
将基因表达与增强子活性之间的关系分为4类：EN:G+；ET:G+；EN:G-；ET:G-。基因(直接和间接靶)，其表达与正常组织活性呈正相关被标记为EN:G+；其表达为与肿瘤特异性活性呈正相关增强子表示为ET:G+；其表达与正常组织活性呈负相关被标记为EN:G-；其表达为与肿瘤特异性活性呈负相关增强子表示为ET:G-。
共鉴定出~800,000个与四类（EN:G+；ET:G+；EN:G-；ET:G-）相关的增强子。ET:G+类中大多数增强子出现在基因1 Mb区域内。（图3）
图3 链接在同一染色体上的增强子探针的分布
在ET:G+类中，乳腺癌有235个基因的增强子探针大于100个；前列腺癌有91个基因的增强子探针大于30个；肾癌有178个基因的增强子探针大于100个。乳腺癌中增强子探针较多的是GATA3, SPDEF, FOXA1, and ESR1 转录因子；前列腺中增强子探针较多的是HOXC6, DLX1, and HOXC4转录因子；肾癌中增强子探针较多的是GLIS1, MAF, SAP30, TRIM15,
and ZNF395 。（图 4）
图4 鉴定与增强子活性相关的TFs a.显示的是ET:G+中每个基因连接增强子探针的数量 ；b. 鉴定的与大量增强器探针有关的前10个TF
3.与乳腺肿瘤特异性增强子相关的TF的特征
GATA3表达量与829个乳腺癌特异性组织增强子探针与不同染色体之间存在关联。（图5）发现MCF7 ER+乳腺癌细胞系的GATA3 ChIP-seq峰在乳腺癌中通过TENET与GATA3相关的肿瘤特异性增强子集合中显著富集，与所有与基因相关的肿瘤特异性增强子或所有肿瘤特异性增强子相比。
图5 乳腺癌增强子相关TF a图：显示的是与GATA3表达正相关的活性增强子的circos图。b所有与GATA3、FOXA1或ESR1的TF ChIP-seq重叠的肿瘤特异性增强子(黄色)，所有与基因相关的肿瘤特异性增强子(红色)，以及与GATA3、FOXA1或ESR1的肿瘤特异性增强子(蓝色)的百分比。
与基底部肿瘤相比，腔内肿瘤中GATA3的表达更高。（图6）
图6 正常和不同亚型乳腺癌组织中增强子探针DNA甲基化和GATA3表达的散点图
探针在非基底乳腺肿瘤中特异性未甲基化。（图7）
图7 基因组浏览器屏幕截图，增强剂(包含探针cg04747693)在乳腺肿瘤中处于活跃状态，与GATA3的表达呈正相关;该探针位于MCF7细胞的H3K27Ac和GATA3峰内，并在非基底乳腺癌细胞中特异性发现的低甲基化区域
4.前列腺肿瘤特异性增强剂网络的特征
与前列腺肿瘤中最具肿瘤特异性增强剂探针相关的前2个, HOXC6和DLX1，分别与100多个肿瘤特异性增强剂探针相关(图4b)，由于这两个TF的研究比较少，作者利用 siRNA在前列腺细胞C42B中分别对两个TF进行敲除，结果显示（图8），HOXC6和DLX1均显著下调；敲除HOXC6组的下调基因明显高于敲除DLX1组，敲除HOXC6组的上调基因略低于敲除DLX1组，两者上调基因和下调基因存在交集。
图8 前列腺细胞系中HOXC6和DLX1敲除结果
5. ZNF395相关增强子在肾癌中具有共同的新生基序
ZNF395基因位于8p21, TENET发现增强子探针cg12116192的低甲基化(距离ZNF395的TSS约500 kb)与ZNF395基因的表达呈正相关。（图9 a/b）ZNF395表达水平与近200个位于整个基因组的低甲基化增强子探针正相关。(图9c)
由于ZNF395还没有被广泛研究过，也没有针对这个TF发布的ChIP-seq数据集，如果这些连接的增强子实际上是ZNF395调控的增强子，它们可能包含一个共同的Motif。在使用GFP抗体在K562细胞中识别的7767个增强子中表达了GFP标记的ZNF395，在KIRC中识别的所有与ZNF395相关的增强子中，以及在本研究中使用的所有远端NDR区域中，有两个基本的区域。所以作者提取了两类ZNF395调控的增强子的Motif，Motif1是182个增强子（183个增强子中）的基序，Motif2是75个增强子（183个增强子中）的基序（图9 d）。在肾癌中与除ZNF395以外的基因相关的增强子中，只有不到25%具有这些基序，而在TSS远端的所有NDRs中，只有不到20%具有这些基序。事实上，这些基序基本上在所有与ZNF395相关的增强子中都存在，这表明它们可能是ZNF395的直接结合基序。
图9 肾肿瘤组织中的ZNF395相关增强子。a.基因组浏览器屏幕截图附近的肿瘤特异性增强器探针cg12116192。b.增强子探针cg12116192和ZNF395在正常和肿瘤肾组织中DNA甲基化水平的散点图。c.Circos图显示183种增强子在KIRC中处于与ZNF395基因表达正相关的活跃状态。d.左图显示了与ZNF395表达相关的183个增强子中发现的两个从头开始的Motif的log;右图为增强子也motif的分布关系。
总结评价
这篇文章关注了比较热门的三个点：癌症、增强子、转录组因子，关注癌症也是目前发病较高的三个肿瘤类型：乳腺癌、前列腺癌、肾癌。对增强子根据分布的不同进行分类讨论，最终分别描述了不同类型的癌症相关的增强子与转录组因子之间的关系。
不足之处：这些增强子是如何影响癌症发展的机制未阐述的十分明确，以及增强子如何网络作用也没有详细展开描述。
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