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编者按
在前期的推文中，我们介绍了一些circRNA在肿瘤发生、心血管中发挥重要的功能，除了吸附miRNA发挥内源性竞争RNA的功能，circRNA还能够识别、转运及储存蛋白参与调控，甚至在特定的条件下能够启动翻译。今天的推文将结合最新的研究报道，探究circRNA在先天性免疫反应中所发挥的功能。
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知识累积
免疫识别主要分为以下两种：
- 模式识别受体
包括the helicases MDA5 (melanoma differentiation associated protein 5), RIG-I, and the Toll-like receptor 3 (TLR3)，能够识别不同外源核酸分子的生化特征，通过激活转录因子和细胞因子启动免疫应答。 - 具有直接抗病毒活性的核酸受体
PKR (dsRNA-activated protein kinase), the 2-5A system (20–50 oligoadenylate synthetase [OAS] and RNase L), and adenosine deaminase acting on RNA 1 (ADAR1). 它们能够识别不同长度的dsRNA，通过抑止其翻译、触发降解或致病性dsRNA的化学修饰直接作用于病毒RNA上。
circRNA在免疫上的研究报道
circRNA相关的免疫报道
有证据显示，将体外产生的circRNA转染到哺乳动物细胞中，能够通过识别受体 RIG-I，有效地激活免疫信号传导，抵抗病毒；但是使用人类内含子序列产生外源circRNA能够消除该过程，但是之间的机制尚不清楚。
免疫因子 NF90/NF110 能够在核内通过其双链RNA结合结构域与环化外显子侧翼的内含子序列的互补，促进circRNA的形成。在细胞质中能够与成熟的circRNA互作形成circRNP复合物，受到病毒感染时，能够释放 NF90/NF110 与病毒mRNA结合，参与抗病毒免疫应答。
最近的研究报道显示，DBR1基因缺陷导致脑干病毒性脑炎易感性。DBR1编码蛋白是现已知的唯一一种RNA套索脱支酶，DBR1突变患者的成纤维细胞含有比对照细胞更高的RNA套索水平，这种差异在HSV1感染期间变得更加显著。而套索结构可能与circRNA水平相关。
Poly I:C treatment
以下解释来源于wiki
聚肌胞苷酸（缩写为Poly I:C，英文名全称Polyinosinic acid-polycytidylic acid，中文别名：聚胞苷酸；聚肌胞；聚肌胞苷酸）由肌苷酸与胞苷酸多聚而成。是一种免疫增强剂。它的钠盐可以用来模拟病毒感染。
Poly I:C与toll-like receptor（TLR）3相互作用，TLR3是B细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面的一种蛋白。Poly I:C与一些病毒的双链RNA在结构上相似，可以作为TLR3的天然增强剂。因此，Poly I:C通常作为双链RNA的类似物来进行免疫学研究。
主要结果及分析
发现及确定病毒侵染后，circRNA水平下调的原因
比较多种处理下，circRNA仅在 poly(I:C)处理下显著下调，在α-鹅膏霉素以及herring testes DNA (HT-DNA) and IFN-stimulating DNA (ISD) mimicking dsDNA stimulation, lipopolysaccharide (LPS) and thapsigargin (Tg) mimicking bacterial infection, and interferon (IFN)-b or IFN-g as inflammatory cytokines分别处理下，并没有与前者类似的结果，说明在模拟致病性dsRNA或者病毒感染过程中，circRNA水平下调并不是由于转录水平的干扰 (fig 1d,e)。
根据报道，poly(I:C) 和EMCV能够通过激活 RNase L催化病毒RNA降解，从而限制其传播。因此，作者通过敲除以及敲低 RNase L 的Hela细胞，分别通过 poly(I:C) 处理的circRNA水平分析，以及回复突变实验结果，显示RNase L是病毒感染后circRNA降解的关键酶 (fig 1i)。
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circRNA的大规模下调是否与先天性免疫响应相关
作者使用组氨酸标记多个纯化的免疫因子，用于体外竞争结合筛选，结果显示circRNA优选与第二类核酸受体 (具有直接抗病毒活性的核酸受体) 结合，且PKR具有最高的偏好性 (fig.2c)。
PKR是一种IFN诱导型Ser / Thr蛋白激酶，由dsRNA直接激活，在dsRNA的细胞质反应中发挥核心作用。 PKR通常以非磷酸化和无活性的形式存在于细胞质中，并在感染后被自身磷酸化激活以启动信号转导，最终抑止蛋白质合成。根据其激活特性， (PKR需要长> 33 bp 的dsRNA激活，长度为79 bp时达到最大激活，而16-33bp短dsRNA可以结合PKR单体并在体外阻断其活化) (fig.2 f.g) ，作者对比线性转录本，仅在circRNA中实现了报道中的强相互作用 (fig.2h)。
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Figure 2. circRNAs Preferentially Bind to PKR and Prevent PKR Activation In Vitro
这些环状RNA如何集合PKR并调剂其活化的
作者使用优化后的 SHAPE-MaP (selective 20 -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling) 方法用于比较环状RNA与线性转录本的分子结构。由于对方法理解的不透彻，这里将描述一下实验的主要结论，有需要的小伙伴还需查看原文确认。
首先，作者发现circSHAPE-MaP反应的两个生物学重复高度相关，表明circRNA在结构上是稳定的（fig.3 c），而线性RNA似乎是动态的和不稳定的。其次，由于检测到的circRNA长度比其线性同源RNA短得多，所以circRNA中的RNA二级结构（R16 bp，长度）较容易检测，而线性RNA倾向于形成长距离二级结构（fig.3 d.e）。第三，12个circRNA倾向于在16-26bp之间形成不完整的短RNA双链体（fig.3 f），而这些结构在其线性同源RNA片段中较少见 (fig.3 e.f)。
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内源性含有dsRNA的circRNA的PKR活化验证
首先，作者基于上述实验结果，不同的circRNA能够独立的在体外抑止PKR。因此作出以下假设，一组的circRNA可能与细胞中的PKR结合以抑制其磷酸化。通过比较不同组中circRNA的拷贝数目比较，推测大多数circRNA能够形成1~4个 dsRNA区域。并通过实验验证circRNA而不是线性转录本导致PKR水平及下游EIF2a磷酸化水平的降低。
因此能够支持，在先天免疫反应的早期阶段，PKR激活需要RNase L介导的大量circRNA快速降解。
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延伸：SLE (系统性红斑狼疮) 分析
SLE是一种常见且可能致命的自身免疫疾病，其特征在于自身抗体产生和I型IFN特征。早期研究表明，PKR的高表达可能与SLE有关。
结合临床样本，与正常对照相比，从SLE患者分离的PBMC (外周血单核细胞群) 中p-PKR水平显着增加，而具有dsRNA的circRNA水平降低，并且检测到了RNase L的活化。同时，RNA-seq分析显示，与来自正常对照的那些相比，来自SLE患者的所有检查细胞类型中circRNA的数量（fig.6c）和表达水平（fig.6 d）全局减少。
由于PBMC中包含，单核细胞、B细胞和T细胞，作者初步已经确认在T细胞中过表达circRNA，同样也能够抑止PKR的活化及其他下游底物，说明调节circRNA表达水平在抑制自身免疫疾病中过量先天免疫应答的具有潜力。
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